Culture‐Based and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Analysis of the Bacterial Community from Chungkookjang,a Traditional Korean Fermented Soybean Food

Abstract: The bacterial community of Chungkookjang and raw rice‐straw collected from various areas in South Korea was investigated using both culture‐dependent and culture‐independent methods. Pure cultures were isolated from Chungkookjang and raw rice‐straw on tryptic soy agar plates with 72 to 121 colonies and identified by 16S rDNA gene sequence analysis, respectively. The traditional culture‐based method and denaturing gradient gel electrophoresis analysis of PCR‐amplified 16S rDNA confirmed that Pantoea agglomerans and B. subtilis were identified as predominant in the raw rice‐straw and Chungkookjang, respectively, from Iljuk district of Gyeonggi province, P. ananatis and B. licheniformis were identified as predominant in the raw rice‐straw and Chungkookjang from Wonju district of Gangwon province, and Microbacterium sp. and B. licheniformis were identified as predominant in the raw rice‐straw and Chungkookjang from Sunchang district of Jeolla province. Other strains, such as Bacillus, Enterococcus, Pseudomonas, Rhodococcus, and uncultured bacteria were also present in raw rice‐straw and Chungkookjang. Practical Application: A comprehensive analysis of these microorganisms would provide a more detailed understanding of the biologically active components of Chungkookjang and help improve its quality. Polymerase chain reaction‐denaturing gradient gel electrophoresis analysis can be successfully applied to a fermented food to detect unculturable or more species than the culture‐dependent method. This technique is an effective and convenient culture‐independent method for studying the bacterial community in Chungkookjang. In this study, the bacterial community of Chungkookjang collected from various areas in South Korea was investigated using both culture‐dependent and culture‐independent methods.     

剑南春酒曲细菌群落结构的分析

以剑南春中温大曲曲药为研究对象,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术研究浓香型白酒细菌的群落结构及其多样性。细菌DGGE指纹图谱揭示了剑南春中温大曲曲药中乳酸菌的种群多样性,所鉴定出的乳酸菌包括Lactobacillusbrevis、L.sakei、L.curvatus、L.sanfranciscensis、L.mindensis、L.reuteri、L.farciminisL.panis、L.helveticus、L.fermentum、L.pontis、Staphylococcusxylosus、Weissellaconfusa、Weissella cibaria。同时,还检测到了传统培养方法未检测到的Saccharopolysporaspinosporotrichia、Weissellaconfusa、Weissellacibaria、Klebsiellaoxytoca和Staphylococcusxylosus等细菌。曲药微生物种群多样性特征的解析为深入研究白酒微量香味物质生成机理提供了技术支撑。     

冷却肉中假单胞菌16S rRNA基因不同可变区片段DGGE研究

为揭示变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术存在的一些技术缺陷,本实验以冷却肉中不同假单胞菌相关克隆为例,分别在V3和V6～V8两个不同可变区片段比较不同假单胞菌的16S rRNA基因差异。结果表明,以不同可变区为扩增目标进行研究,假单胞菌的DGGE图谱结果存在差异;基因片段序列的G+C含量与图谱中迁移位置并非绝对相关。DGGE技术的这一缺陷很大程度上是由细菌16S rRNA基因序列的自身特性所引起的。     

不同发酵时期酸马奶细菌群落结构

以聚合酶链式反应扩增16S rRNA基因序列采用454焦磷酸测序方法分析酸马奶传统发酵过程中细菌群落结构演替变化。结果表明：在发酵的初期细菌多样性最高,而细菌丰度在72 h时最高;硬壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为酸马奶中的优势细菌门;乳杆菌属（Lactobacillus）和乳球菌属（Lactococcus）为其优势细菌属;随着发酵时间的延长,各个细菌门与属都存在上升或下降的趋势变化。本研究可为其他乳制品发酵过程中细菌群落结构研究提供借鉴。     

变性梯度凝胶电泳法初步解析茯砖茶渥堆发酵过程中细菌群落结构

为解析茯砖茶渥堆发酵过程中细菌群落结构和种类,对渥堆过程中不同时间段细菌16S rDNA 的V3可变区进行扩增,对细菌变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）图谱中条带进行克隆、测序和序列比对。结果表明：黑毛茶在渥堆过程中以渥堆24 h为分界点,前后各自细菌群落结构相似,但前后的差异较大;从16S rDNA 的V3可变区比对结果证明黑毛茶渥堆过程中有诺卡氏菌属、新鞘脂菌属、短波单胞菌属、韦龙氏假单胞菌属、突那梭菌属、克雷伯氏菌属、乳杆菌属及不可培养的ε-变形菌、腐败螺旋菌属、黏球菌属、根瘤菌属和未知分类地位的不可培养细菌6 种。采用DGGE指纹图谱能更全面、更真实地反映黑毛茶渥堆发酵过程中细菌群落的结构和多样性变化。     

应用PCR-DGGE技术检测发酵食品和饲料中真菌菌群

PCR-DGGE 技术是近年来新兴的一项开展微生物分子生态学研究的工具。本文介绍了PCR-DGGE 技术的基本原理和技术背景,总结了应用PCR-DGGE 研究发酵食品和饲料中真菌菌群时所设计或选择的PCR 引物,图示了获得DGGE 图谱中DNA 条带序列信息的实验流程,并列举了DGGE 技术的一些局限性和优化策略。综述结果有助于建立可行的PCR-DGGE 技术方案用于发酵过程或产品中真菌群落结构和演替规律的检测分析。     

基于16S rRNA基因V3-V4区高通量测序分析东北自然发酵酸菜中细菌群落结构

为探究东北自然发酵酸菜中细菌群落结构,本试验采用454 FLX+平台对东北地区传统自然发酵的16份酸菜汁样品中细菌16S rRNA基因的V3-V4区进行测序。通过454焦磷酸测序,共得到302327条有效序列。计算Chao 1指数、Shannon指数和Simpson指数,对样品菌群的Alpha多样性进行评价,发现松原和大庆样品的细菌群落具有较高的丰富度。Beta多样性分析发现黑龙江、吉林和辽宁省份样品中存在交叠细菌物种,但含量极低。Heatmap图显示各省份的优势菌属各不相同。样品群落结构分析表明大庆、黑河和松原样品中乳杆菌含量超过50%,黑河样品中乳杆菌含量高达69.6%。KEGG统计结果表明高纬度地区存在着一定数量的耐寒细菌。此外,本试验首次在发酵食品中发现污蝇解壳杆菌属细菌(wohlfahrtiimonas),显示出高通量测序技术相对传统纯培养技术的优势。     

浓香型和芝麻香型白酒酒醅中微生物菌群的研究

对白酒窖池发酵的全程跟踪取样,借助于PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)和16S rRNA基因文库两种方法,对比研究了江苏地区浓香型和芝麻香型白酒酒醅在发酵过程中的微生物茵群结构.DGGE图谱分析显示,随着发酵时间的延长,酒醅中的微生物多样性不断降低;发酵结束时Lactobacillus manihouvorans成为最主要的优势菌种.16S rRNA克隆文库的测序结果在数据库中进行比对后表明,浓香型和芝麻香型酒醅中的微生物种属存在巨大差异,仅有Weissella、Bacillus、Acetobacter和Lactobacillus 4个属的微生物在两个文库中均能检测到,发现并鉴定出在白酒曲药和酒醅的研究中尚未报道的细菌属.     

液熏罗非鱼片加工过程中微生物群落的PCR-DGGE 分析

为弄清液熏罗非鱼片加工过程中微生物污染的源头,以进一步防控产品的微生物污染提供依据。应用基于细菌16S rDNA 的PCR-DGGE(PCR-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR- 变性梯度凝胶电泳)技术分析液熏罗非鱼片主要加工关键环节的微生物群落结构,提取样品中的细菌总DNA,对细菌的16S rDNA 的V6～V8 区段进行PCR 扩增后,进行变性梯度凝胶电泳(DGGE),对DGGE 图谱进行微生物多样性分析,对主要条带进行序列分析并构建系统发生树。结果表明：10 个条带所代表的优势种很可能来源于以下几个属：巨型球菌属(Macrococus)、微球菌属(Micrococus)、肠道细菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、弧菌属(Vibrio)、突柄杆菌属(Prosthecobacter)、布特菌属(Buttiauxella),其中肠道细菌属、微球菌属、假单胞菌属和弧菌属细菌都具有使产品腐败的潜能。本研究表明：液熏罗非鱼片中呈现微生物多样性,PCR-DGGE 技术可用于研究液熏罗非鱼片加工过程中的微生物群落结构及变化,且具有一定的优越性。     

内蒙古酸马奶中乳酸菌多样性的研究

采用16S rRNA基因全序列测定和聚类分析技术,对酸马奶中的乳酸菌进行了准确鉴定并构建了乳酸菌的系统发育树.然后对乳酸菌菌群进行了多样性分析,结果显示,酸马奶中的优势乳酸菌分别为:Lactobacillus plantarum(10%),Lactobacillus brevis(8%),Lactobacillus casei(7.8%),Enterococcus faecium(17%),Enterococcus faecalis(14%),Lactococcuslactis(19%),Lactobacillus acidlophilus(5%),Lactobacillus paracasei(2%),Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus(4%),Lactobacillus helveticus(4%),Enterococcus durans(4%),Leuconostoc mesenteroides (4%),Leuconostoc garlicum(1%),Streptococcus thermophilus(1%).     

中高温大曲和曲房细菌群落的相关性

为了解多粮浓香型白酒厂中高温大曲和曲房细菌群落的相关性,采用改良NA培养基和高氏I号培养基对细菌进行分离。经过表观去除冗余后,从多家规模多粮浓香型白酒厂的中高温大曲生产环境(曲房)和大曲分离得到217株细菌。对这217株菌进行16S rRNA基因的系统发育分析及纤维素维素分解能力、淀粉水解能力、7%乙醇耐受能力和pH 4.5耐受能力进行了检测。发现中高温大曲和曲房细菌群落均呈现出一定的多样性,二者的优势菌均为Bacillus,且分别以Staphylococcus和Streptomyces为次优势属;中高温大曲和曲房环境中均存在一定数量具有应用前景的微生物资源;2个细菌群落组成及具有纤维素分解能力、淀粉水解能力和7%乙醇耐受能力的菌株分布均存在高度的一致性,环境对中高温大曲细菌群落影响巨大。     

浓香型白酒窖泥、出窖糟醅细菌区系的相似性分析

分别建立多粮浓香型白酒窖池的窖泥和出窖糟醅的16S rRNA基因克隆文库,在利用DOTUR1.53软件对691条有效序列进行分析的基础上,对序列进行Blastn和EzTaxon相似性分析。发现窖泥和出窖糟醅中均存在丰富的细菌多样性;窖泥中180条序列分别与糟醅中264条序列100%相似,各占2个克隆文库序列总数的51.14%和77.88%,这些序列主要属于Lactobacillus、Staphylococcus、Serratia、Clostridium 和一些潜在新类群。结果显示：多粮浓香型白酒发酵过程中,窖泥和糟醅具有较高相似度的细菌区系,其间存在较大规模的细菌相互扩散,发生相互扩散的细菌包括Lactobacillus、Serratia和Clostridium等属的菌株及大量潜在新分类单位菌株。     

Bacterial Community Dynamics of Salted and Fermented Shrimp based on Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

The Korean traditional seafood jeotgal is consumed directly or as an additive in other foods to improve flavor or fermentation efficiency. Saeujot, made from salted and fermented tiny shrimp (SFS; Acetes japonicus), is the best‐selling jeotgal in Korea. In this study, we reveal the microbial diversity and dynamics in naturally fermented shrimp by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). The population fingerprints of the predominant microbiota and its succession were generated by DGGE analysis of universal V3 16S rDNA polymerase chain reaction (PCR) amplicons. Overall, 17 strains were identified from sequencing of 30 DGGE bands. The DGGE profiles showed diverse bacterial populations in the sample, throughout the fermentation of SFS. Staphylococcus equorum, Halanaerobium saccharolyticum, Salimicrobium luteum, and Halomonas jeotgali were the dominant bacteria, and their levels steadily increased during the fermentation process. Certain other bacteria, such as Psychrobacter jeotgali and Halomonas alimentaria appeared during the early‐fermentation process, while Alkalibacterium putridalgicola, Tetragenococcus muriaticus, and Salinicoccus jeotgali appeared during the late‐fermentation process. The members of the order Bacillales were found to be predominant during the fermentation of SFS. Furthermore, S. equorum was identified as the dominant bacterial isolate by the traditional method of culturing under aerobic and facultative anaerobic conditions. We expect that this information will facilitate the design of autochthonous starter cultures for the production of SFS with desired characteristic sensory profiles and shorter ripening times.     

PCR-DGGE技术在应用过程中的常见问题分析

PCR-DGGE指纹分析技术近来被引入到食品微生物的研究中,作为一项分子手段在食品微生态领域的广泛应用显示了它在分析复杂微生物区系遗传多样性和监控种群动态性方面独特的优越性。文中结合近10年相关文献对PCR-DGGE技术使用中存在的问题进行了综述,包括菌种鉴定、扩增区域的选择和电泳条件的优化3个方面,另外还讨论了其在今后应用中的潜力及前景。     

PCR-DGGE分析西藏雪莲菌细菌多样性

细菌是雪莲菌中的重要功能菌群,对于雪莲菌的形成及其功能作用的发挥有着重要作用,因而探明其细菌的种群特征具有重大意义。本文采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和16S r DNA测序技术对3个西藏雪莲菌颗粒(A、B和C)中细菌多样性进行了研究。DGGE电泳结果显示,样品的丰度值介于12~16之间,细菌多样性指数在1.79~2.11之间,相似性指数在0.62~0.77之间。通过对DGGE指纹图谱优势条带切胶测序结果显示:它们分别属于马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)、气单胞菌属(Aeromonas)和醋酸菌属(Acetobacter)。旨在为雪莲菌微生物资源开发以及加快雪莲菌工业化生产奠定基础。     

利用非培养技术研究芝麻香型白酒高温大曲的细菌群落多样性

采用构建16S rDNA克隆文库的非培养方法,对我国芝麻香型白酒高温大曲细菌的群落结构及其多样性进行研究。文库中含有24个分类操作单元(OTU),优势菌属(丰度)分别为Thermoactinomyces sp.(51.99%),Kroppenstedtia sp.(17.38%),Saccharopolyspora sp.(13.87%),Lactobacillus sp.(6.95%)和Weissellasp.(4.96%)。首次在高温大曲中发现Thermoactinomyc vulgaris和Kroppenstedtia eburnea;同时发现3个潜在细菌新种,分属于Saccharothrix sp.,Streptoalloteichus sp.和Pseudofulvimonas sp.。     

低温贮藏对冷鲜鸡腐败菌菌群变化的影响

利用传统平板培养和变性梯度凝胶电泳(DGGE)指纹图谱相结合的方法,对冷鲜鸡低温贮藏期间的腐败菌菌群变化进行了分析。传统培养结果显示,冷鲜鸡的初始菌群主要为肠道菌、乳酸菌和葡萄球菌;4℃贮藏条件时微生物生长速度高于0℃和-1.5℃;贮藏6 d后,4℃贮藏样品的优势菌群为假单胞菌,0℃和-1.5℃贮藏下样品的优势菌群为葡萄球菌。通过变性梯度凝胶电泳法直接对冷鲜鸡中的菌群变化进行了分析,发现不动杆菌、伯克霍尔德氏菌、假单胞菌、肠杆菌,腐生葡萄球菌及乳球菌是样品中的主要污染菌;4℃贮藏时,假单胞菌条带逐渐变亮,0℃和-1.5℃条件下菌群的条带亮度变化不明显。本研究发现贮藏温度对样品中菌群多样性的变化影响较大,冰点温度下贮藏更利于冷鲜鸡中嗜冷菌的控制和产品的保鲜。     

基于混合培养和高通量测序分析云南传统发酵豆豉中活性细菌群落

选择两个使用传统发酵的豆豉样品,先进行混合预培养,再对混合培养液进行DNA提取和16S rRNA基因扩增及焦磷酸测序,最后对得到的序列进行分析。结果表明：两个样品在序列相似度为98%时多样性均较高。其中XG_1的主要细菌为肠球菌、甲基营养型芽孢菌和乳酸片球菌,在XG_2中的主要细菌为枯草芽孢杆菌和甲基营养型芽孢杆菌。