用部分氨基酸序列对家蚕丝胶的表征

从桑蚕鲜茧制取丝胶,采用凝胶电泳法分离出3种主要丝胶A、M和P,经赖氨酰内切酶、胰蛋酶降解、逆相色层分离出氨基酸碎片,再利用气相定序器确定了丝胶的氨基序列,并根据丝胶Ser 1基因编码顺序表征了3种丝胶的基本结构,表明丝胶A有别于丝胶M和P,因其不含构成Ser 1蛋白质主要部分的38-氨基酸重复。     

用部分氨基酸序列对家蚕丝胶的表征

为了证实家蚕的丝胶蛋白质和丝胶基因之间的对应关系，用赖氨酰肽内切酶水解丝胶，对得到的片断N端序列进行测定，得到茧层丝胶的部分氨基酸序列，然后和Ser1基因对应的多肽进行比较。研究表明，丝胶M（丝胶中含量较多的成分）是Ser1基因的产物，而丝胶A（主要分布在茧的乱丝和外层）却不是Ser1基因的产物。此外，酶解后的图谱显示，P是Ser1基因的较小产物。预计丝胶A的性质和丝胶M和P不同，因为它不含构成Set1蛋白质主要部分的38个氨基酸重复序列。     

基于识别重叠序列特性的限制性内切酶的重组表达策略研究

甲基转移酶可以保护宿主基因组DNA免受限制性内切酶的消化,根据这一特性,经典的限制性内切酶制备策略是首先通过表达与其配对的甲基转移酶来保护宿主菌株,然后再共表达限制性内切酶,即“一对一”的重组表达模式。作者设计了一个新的策略：通过共表达识别重叠序列的甲基转移酶来保护宿主菌株,以制备限制性内切酶。首先将识别重叠序列的甲基转移酶转入大肠杆菌ER2566,以保护宿主基因组DNA,然后将能识别重叠序列的多个限制性内切酶分别转入该宿主菌株,以进行限制性内切酶的重组表达,即“一对多”的重组表达模式。根据这一方法,利用甲基转移酶M.Esa Dix5 I、M.Alu I和M.Hha I实现了识别重叠序列(TTAA、AGCT和GCGC)的一系列限制性内切酶的重组表达,还利用甲基转移酶M.Alu I成功实现了两个新的R.Sac I同裂酶R.Eco SP4ORF25090P和R.Gma5ORF28P的重组表达。该方法简化了对抵抗限制性内切酶消化的宿主菌株的大量筛选工作,并提供了大规模制备限制性内切酶的能力。这一方法也可用于发现其他微生物中新的同工酶或同裂酶。     

甜荞苯丙氨酸解氨酶基因PAL的克隆及序列分析

利用RT-PCR技术,首次从甜荞(Fagopyrum esculentum)中克隆得到苯丙氨酸解氨酶基因(PAL)的cDNA ORF序列,命名为FePAL。该序列长2169bp,编码722个氨基酸,与其他植物PAL基因同源性较高,为80%～97%,其推导的氨基酸序列含有PAL酶活性中心特征序列GTITASGDLVPLSYIA和多个脱氨基、催化活性位点。系统发育树表明,甜荞PAL基因与苦荞PAL基因聚类关系最近。     

利用全基因组序列优化气单胞菌脉冲场凝胶电泳分型方法

目的对气单胞菌脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法从限制性内切酶的选择和电泳条件设置上进行优化,减少片段共迁移,使片段在电泳中分布均匀且利于分析。方法利用6个种的气单胞菌的全基因组数据,通过BioEdit软件对基因组序列进行677种酶的限制性片段分析,选择产生片段数量适宜的、有效片段比例高的酶作为备选酶。对片段长度取以10为底的对数作为自变量,以片段在泳道中的相对迁移距离作为应变量,计算片段长度-相对位置拟合公式,并模拟备选酶的电泳效果图。利用气单胞菌分离株对备选酶进行试验验证,确定PFGE分型方法,并用其对腹泻分离株进行分型应用。结果经Bio Edit分析,根据片段数量及有效片段比例,PmeⅠ、PacⅠ、SwaⅠ比XbaⅠ更适合于气单胞菌的分型。从PFGE模拟效果及分离株试验验证看,Pac Ⅰ、PmeⅠ的限制性片段的分布比XbaⅠ和SwaⅠ更均匀,片段重叠更少。最终确定PmeⅠ、PacⅠ分别为气单胞菌PFGE分型的首选酶和次选酶,脉冲场电流转换时间为2.16~63.8 s。16株腹泻分离株PFGE分型辛普森多样性指数为99.17%。结论优化的PFGE方法使用PmeⅠ、PacⅠ作为气单胞菌PFGE分型的限制性内切酶,该方法产生的片段数量与分布都优于XbaⅠ,在腹泻分离株的分型中能获得良好的分辨率。此研究提供的优化程序可用于其他细菌PFGE方法的建立或优化。     

黑曲霉内切β-葡聚糖酶的纯化和性质

黑曲霉(Aspergillus niger)的粗酶滤液经过硫酸铵沉淀和四种色谱CM-Sephadex C-50离子交换色谱、DEAE-Sephadex A-50离子交换色谱、POROS 20 HQ离子交换色谱和TSK-G3000SW凝胶色谱,从中提纯了一个新的内切β-葡聚糖苷酶该酶经SDS-PAGE电泳检测分子量为36.0KD,该酶活力的最适温度为70℃,最适pH值为3.6 纯化后的该酶只能降解羧甲基纤维素,不能降解微晶纤维素,对蔗糖、麦芽糖和纤维素也不起作用。其N-末端部分氨基酸序列为V F E W F G C N E C G A E F Tx N I P G。     

植物乳杆菌和蛋白酶协同发酵水解大米蛋白ACE抑制肽高活性组分的氨基酸序列分析

利用低大米蛋白制备过程发酵水解液中富含大米蛋白和肽。以乳杆菌L2-18+风味蛋白酶/菠萝蛋白酶+胃蛋白酶/酸性蛋白酶分步获得的大米蛋白水解液为研究对象,通过超滤获得小于3 kDa蛋白肽。经阳离子交换、凝胶柱层析和高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)三步分离纯化,确定出高活性ACE抑制肽组分,IC_(50)值为33.81μg/mL。经液质联用(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)鉴定分析,其多肽序列为VVFFAAAL。     

脯氨酸特效蛋白内切酶代替硅胶的应用试验

脯氨酸特效蛋白内切酶是专一在氨基酸-脯氨酸的羟基端裂解多肽,可有效防止啤酒中冷混浊的形成。     

海洋菌株Mitsuaria sp. SH-50产嗜热性壳聚糖酶CsnSH50的酶学性质表征及其应用

实验室从中国海南滨海虾蟹养殖区泥土样品中筛选到一株高产壳聚糖酶的海洋菌株Mitsuaria sp. SH-50,优化后该菌株产酶时间仅为12 h,产酶活性可达26.6 U/mL。该研究对其胞外壳聚糖酶进行分离纯化和酶学性质表征并进行壳寡糖制备的小试放大试验,以期进一步明确该菌株在壳寡糖生产上的实际意义。结果表明：壳聚糖酶CsnSH50分子量约为41 ku,纯化后CsnSH50比酶活力为7 462.50 U/mg,最适反应pH值为4.5,温度为75 ℃,在pH值2.5~8.5及温度低于50 ℃条件下稳定性较好。最适条件下,稀释后CsnSH50的最大反应速率Vmax=29.41 U/mL,米氏常数Km=1.71 mg/mL,1 mmol/L的K+、Ca2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+对CsnSH50的酶活力有明显正激活效应,10 mmol/L的Mn2+对其正激活效应可达412%。TLC和ESI-MS结果表明：CsnSH50水解壳聚糖的最终产物主要为壳二糖、三糖、四糖。小试放大试验结果显示：制备5%（m/V）壳寡糖溶液时,壳聚糖溶液的初始pH值3.5,温度75 ℃,水解120 min时壳寡糖产率达到92.1%,产物平均聚合度为10.2。综上,CsnSH50具有酶活性高、热稳定性好、耐酸等特性,同时是一种鲜有报道的嗜热性壳聚糖酶,具有良好的工业应用潜力。     

组合酶对复合骨素酶解液呈味物质的影响

为探究组合酶对牛骨素和鸡骨素的复合骨素酶解液呈味物质的影响,选取四种组合酶(木瓜蛋白酶+风味蛋白酶、菠萝蛋白酶+风味蛋白酶、碱性蛋白酶+风味蛋白酶、复合蛋白酶+风味蛋白酶)制备复合骨素酶解液,测定四种复合骨素酶解液的水解度、游离氨基酸、呈味核苷酸、味精当量(Equivalent umami concentration,EUC)、肽分子量分布等呈味物质指标,并进行对比分析。结果表明:碱性蛋白酶+风味蛋白酶(Alkaline proteinase+Flavourzyme,A+F)和复合蛋白酶+风味蛋白酶(Protamex+Flavourzyme,P+F)酶解液的水解度最大,分别为10.67%和11.27%;对呈味游离氨基酸组成分析发现,A+F酶解液鲜味氨基酸、苦味氨基酸、无味氨基酸含量最高,A+F和P+F酶解液总游离氨基酸含量最高;四种酶解液中肌苷酸较另两种核苷酸含量高,A+F酶解液总核苷酸含量最高;比较四种酶解液味精当量,A+F酶解液EUC值最大;A+F和P+F酶解液中分子量<1000 Da肽段含量最高,制备复合骨素酶解液的呈味效果更好;主成分分析表明A+F组合酶综合得分最高,A+F组合酶为美拉德反应提供丰富反应底物。     

毕赤酵母中内切β-1,4葡聚糖酶的表达及共培养制备低分子质量黄原胶

低分子质量黄原胶具有抑菌、益生及抗氧化等多种生物活性,因此通过水解制备低分子质量黄原胶具有广阔应用前景。该研究将来源于绵羊瘤胃元基因组的内切β-1,4-葡聚糖酶首次在毕赤酵母中表达,其在pH 7.0和75℃下发挥最佳作用,并有较高的pH和温度稳定性。此后,建立了毕赤酵母和野油菜黄单胞菌的共培养体系并对发酵条件进行优化,其中野油菜黄单胞菌生成的黄原胶可以被毕赤酵母分泌的内切β-1,4-葡聚糖酶直接降解产生低分子质量黄原胶。摇瓶水平下,共培养体系中总糖最高为11.4 g/L,水解产物中重均分子质量为2 500 Da的低分子质量黄原胶达到93.79%。该研究为功能性低分子质量黄原胶的工业化生产提供了一个潜在的策略。     

产甘油假丝酵母烯醇化酶基因的克隆及序列分析

从产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)基因文库中分离了一个含烯醇化酶基因(CgENO1)的克隆子.插入片段全长2 456 bp,包含一段1 314 bp的没有内含子的蛋白质编码区,编码一个含438个氨基酸残基的多肽链,其氨基酸序列与来源于酿酒酵母的烯醇化酶相似性为74.3%.多重序列比对显示,产甘油假丝酵母烯醇化酶(CgENO1)含有酵母烯醇化酶全部保守区.对编码区上下游序列分析显示,克隆片段含有典型的酵母基因上下游调控区,是一个完整的酵母新基因.     

牛乳铁素的制备纯化与氨基酸序列分析

对牛乳铁素的制备和分离纯化方法进行研究.牛乳铁蛋白经胃蛋白酶水解,其产物经不同分离介质进行分离纯化,用毛细管电泳检测其纯度.用氨基酸分析仪确定其氨基酸组成,并进行适合度检验.结果表明,采用Butyl-Toyopearl 650M树脂分离,其纯度为95.6%.纯化出的产物氨基酸组成和序列与已知的牛乳铁素无显著差异.