林烟草NsylCBL10启动子的克隆及功能分析

[目的]探究林烟草（Nicotiana sylvestris）类钙调神经素B亚基蛋白（Calcineurin B-like protein,CBL）基因家族成员NsylCBL10的启动子在烟草不同生长发育过程及光信号刺激下的活性变化。[方法]克隆NsylCBL10启动子并初步预测其顺式作用元件;构建NsylCBL10启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）的融合表达载体并将其转入普通烟草（Nicotiana tabacum）,获得转NsylCBL10pro::GUS的纯合材料;利用所获转基因材料探究NsylCBL10启动子在种子萌发期、幼苗期和成熟期的组织特异活性和在幼苗下胚轴的光诱导活性。[结果]预测结果表明,NsylCBL10启动子含有与组织特异性和响应光信号、植物激素和胁迫等相关的顺式作用元件;组织化学染色试验表明,NsylCBL10启动子驱动的GUS基因在种子萌发期主要在子叶节区-根过渡区、根尖表达,子叶伸展期主要在子叶、子叶节区-根过渡区和根尖表达,十字期主要在叶片中表达,成熟期在柱头、成熟的花药、侧根根尖和侧根根基部表达量较高;幼苗下胚轴中,NsylCBL10启动子驱动的GUS的基因表达在光下受到抑制,黑暗下被增强。[结论] NsylCBL10启动子活性在烟草不同发育期的组织中呈现动态变化。在烟草分生能力强的部位和成熟期的花器官中其启动活性较强,在幼苗下胚轴中的启动子活性受到光信号的调控。      

烟草NtCycB2启动子的克隆和组织驱动特性分析

【背景和目的】烟草B型细胞周期蛋白CycB2可以负调控腺毛的发生,为分析烟草Nt CycB2启动子的组织驱动特性。【方法】通过实时定量PCR分析普通烟草NtCycB2-1和Nt CycB2-2两种序列的组织表达差异,克隆NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子序列,对其进行进化分析、顺式元件预测和组织驱动特性分析。【结果】（1）烟草NtCycB2-1和NtCycB2-2均为腺毛优势表达基因,NtCycB2-1的表达量显著高于NtCycB2-2;(2)普通烟草中存在两种NtCycB2启动子序列类型（ProNtCycB2-1和ProNtCycB2-2）,其中ProNtCycB2-1来自于林烟草,ProNtCycB2-2来自于绒毛烟草,这些CycB2启动子中普遍存在ABRE等激素应答元件,以及MYB-motif、MYC-motif和TC-rich repeats等逆境响应元件;（3）以GUS为报告基因,研究NtCycB2-1和NtCycB2-2两个启动子的组织驱动特性发现,NtCycB2-1和NtCycB2-2启动子均能驱动GUS基因在叶片和茎部腺毛中特异表达,其中NtCycB2-1启动...     

菜热休克蛋白基因HSP81.1启动子的克隆与功能验证

本研究从甘蓝型油菜（Brassica napus）基因组中扩增获得热休克蛋白基因启动子,并将其克隆至双元载体pBI121的GUS报告基因上游,构成双元表达载体pBI121 HSP GUS。通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法转化烟草后获得转基因植株。对T1转基因植株研究表明,外源基因在42℃处理1h后开始表达,且即使用同样条件诱导,GUS基因的表达率和表达量在不同生长时期也有差异。在第50d左右的苗期,GUS基因的表达率和表达量高,但随植株老化而逐渐下降。研究显示,利用油菜的热休克蛋白启动子可以达到通过温度控制烟草基因表达的目的。     

烟草NtGCN2启动子的克隆及功能研究

[目的]探究烟草蛋白激酶NtGCN2启动子驱动GUS基因在ABA、SA、AZA和MeJA四种处理下的表达模式.[方法]克隆烟草NtGCN2上游2000bp的启动子序列,并采用Plant CARE和PLACE数据库进行顺式作用元件预测.构建NtGCN2启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的融合表达载体并转化烟草K32...     

烟草抗病毒基因工程研究进展

烟草抗病毒基因工程是快速改良烟草抗病毒性状的一条有效途径,它涉及到抗病毒目的基因的选择、高效转化体系的建立、目的基因在转基因烟草中的检测和表达活性、转基因烟草抗病毒性状的稳定性以及转基因烟草的安全性等问题.对病原菌致病机制、植物抗病机制以及它们互作体系的透彻研究是解决这些问题,使烟草等植物转基因研究在现有基础上产生质的飞跃的根本和关键.     

烟草橙蛋白基因的克隆与生物信息学分析

为了获得烟草OR(NtOR)基因的全长序列和进一步揭示其在特色烟叶形成中的作用,采用同源克隆法从烟草品种K326中克隆了NtOR的全长cDNA和基因组DNA序列,GenBank登录号为JN379458和JN375578.生物信息学分析表明,NtOR基因组DNA全长5027bp,cDNA为1188 bp,编码317个氨基酸残基.NtOR蛋白具有2个跨膜域、1个信号肽剪切位点、5个糖基化位点和11个磷酸激酶修饰位点,二级结构包含12个α-螺旋和20个β-折叠,亚细胞定位于质膜上.系统进化与BLAST分析表明,NtOR是SlOR和ViOR的垂直同源基因.GENEVESTIGATOR数据库的芯片结果显示,NtOR基因在子叶中的表达量最高,其次是成熟叶片、幼茎和花,其他组织器官的表达相对较弱.     

烟草SOC1基因的克隆和表达分析

SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANTS 1（SOC1）基因属MADS-box转录因子家族,在植物成花诱导过程中起关键作用,但在营养生长过程中的调控功能还未获得充分研究。为明确SOC1基因在叶片中的生理作用,克隆到烟草中SOC1基因的完整开放阅读框,全长806bp。农杆菌介导转化烟草后,获得26棵转基因植株,其中23棵鉴定为阳性植株,转化率为88.46%。与野生型烟草K326相比,获得的SOC1过表达烟株开花提前,株高增加,叶片宽大。半定量RT-PCR结果显示,SOC1过表达不影响叶片中Rubisco大亚基、蔗糖磷酸合成酶和蔗糖合成酶基因的表达水平,但提高了抗坏血酸氧化酶的表达水平;提高了碳酸酐酶活性、蔗糖含量和还原性抗坏血酸含量,并降低了抗坏血酸过氧化物酶活性。表明SOC1可能通过影响叶片抗坏血酸库的氧化还原状态而提高碳酸酐酶活性和光合速率。      

接头连接PCR步行法鉴定转基因烟草

应用接头连接PCR步行法,建立了分子水平鉴定不同转基因事件的方法和体系;并利用不同转基因事件外源基因与植物基因组DNA整合位点处核酸序列的差异,设计了不同转基因烟草事件的标签引物,成功地对几个转TMV-CP材料进行了鉴定。     

烟草发状根的诱导和植株再生

发根农杆菌Ar1334工程菌株与烟草叶片共培养，诱导的根在MS无激素培养基上呈现旺盛的生长态势和典型的发状根结构特点，并在附加0．5mg／mL KT的MS培养基上实现了植株再生。发状根经PCR检测扩增出了500bp的rolC目的片断，组织化学检测也证实了GUS基因在发状根及再生植株叶片中的表达。该体系为利用发状根进行外源基因表达，并通过大量培养进行物质生产奠定了基础。     

解淀粉芽孢杆菌的强启动子的克隆与鉴定

利用启动子探针质粒,从解淀粉芽孢杆菌XH7基因组中分离得到1个强度较高的启动子P28,该启动子在大肠杆菌中表达的β-半乳糖苷酶酶活为2 350 Miller U/m L,在枯草芽孢杆菌中的酶活为3 340 Miller U/m L。启动子的序列分析表明该启动子由σK因子识别,由2个启动子串联而成,分别为编码羧基末端加工蛋白酶的基因(ctp A)和编码转醛酶的基因(tal)启动子,为芽孢杆菌启动子库提供了一个新的选择。     

烤烟中砷的检测及砷在烤烟不同部位中的含量

采用硝酸-高氯酸混合酸消解烟样,氢化物发生-原子荧光光谱(HG-AFS)法检测砷(As),并优化了试验条件,方法的线性范围是0~60.0μg·L-1,平均回收率为100.2%。检测了云南省部分主产烟区旺长期烤烟的茎、叶和叶脉中As的含量,并对10组样品数据进行统计分析,结果表明:As在旺长期烤烟不同部位的含量差异较大;其含量平均值大小顺序为:下部叶片 > 下部叶脉、中部叶片 > 上部叶片 > 中部叶脉 > 上部叶脉 > 茎。      

萌发玉米中过氧化物酶的变化及其活力测定条件的研究

通过单因素实验和正交实验,利用愈创木酚比色法研究了萌发玉米中过氧化物酶的提取pH值、影响过氧化物酶活力的各种因素和过氧化物酶活力测定的最佳条件。实验结果表明,过氧化物酶的最佳提取pH值是6.7;各因素对过氧化物酶活性的影响顺序为萌发时间>温度>pH值>反应时间。萌发玉米种过氧化物酶提取的最佳条件为,温度40℃,pH5.4,萌发时间3d,反应时间5min。     

降解南瓜纤维素菌株的分离筛选及酶活测定

目的:筛选出能高效降解南瓜纤维素的菌株,以制备南瓜可溶性膳食纤维。方法:从土壤、腐烂的树叶和水果上分离出具有降解南瓜纤维素的菌株,用刚果红染色透明水解圈进行初筛,然后用CMC-Na、滤纸和南瓜渣为碳源测所有菌株及混合菌株的羧甲基纤维素酶活力,最终选出1株酶活力较高菌株进行下一步实验。结果:共分离到能够有效降解纤维素的共有5株细菌和7株真菌,通过测单菌株和混合菌株的酶活力,表明混合菌株的酶活力最大值比单菌株的酶活力最大值要高3倍之多。结论:混合菌株的酶活力比单株菌酶活力值高,发酵培养72h南瓜渣可溶性多糖降解力最强。     

烟草及其制品中游离烟碱的测定方法研究进展

综述了近30年烟草及其制品中游离烟碱含量测定方法的研究进展,包括溶剂萃取法、顶空固相微萃取法、核磁共振法、Henderson-Hasselbalch法和光谱法等,总结了各个方法的优缺点,并展望了烟草及其制品中游离烟碱含量检测方法未来的研究方向。     

烤烟内生高温菌YYFG3的分离鉴定及所产蛋白酶活性

通过固体分离培养基的分离培养和牛奶琼脂鉴别培养基的鉴别初筛,从烟草(Nicotiana tabacum L.)的初烤烟叶中分离到一株嗜热产蛋白酶菌株,编号为YYFG3,其生长温度范围是30℃-65℃,最适生长温度55℃左右,对pH的耐受范围是5-9,最适范围是6-7;在发酵产酶培养基中,56℃、180 r/min条件下发酵32 h的蛋白酶活力达到最大值35.3 U/mL,故将YYFG3定性为产蛋白酶高温菌株。通过光学显微镜和扫描电子显微镜对该菌株形态特征的观察、相关生化特性的测定、16S rDNA的克隆测序以及对菌株分子遗传进化树的构建,确定菌株YYFG3隶属于土芽孢杆菌属Geobacillus,暂将其命名为Geobacillus sp.YYFG3。菌株YYFG3可作为产蛋白酶高温微生物诱变育种和全基因组育种的良好材料,具有良好的开发应用潜力。      

间氯偶氮安替比林光度法测定烟草中的钙

研究了用间氯偶氮安替比林分光光度法测定烟草中钙的方法。在碱性介质中 ,钙与间氯偶氮安替比林形成 1∶1的蓝色配合物 ,其最大吸收波长为 6 30nm ,表观摩尔吸光系数为 2 .6× 10 4 L·mol- 1·cm- 1,钙含量在 0～ 4 0 μg/ 2 5mL范围内符合比尔定律。烟草中的其它矿物成分对测定不产生干扰 ,与传统的EDTA滴定法相比具有灵敏度高、选择性好、简便快速等优点 ,用于测定烟草中的钙 ,其回收率为96 .2 %～ 99.3% ,RSD为 2 .8%。     

ASE-超高效液相色谱法快速测定烟草中的多酚类物质

摘要:建立了加速溶剂萃取(ASE)-超高效液相色谱(UPLC)同时测定烟草中6种多酚物质的快速方法。用50%的甲醇水溶液在50℃下对烟草样品加速溶剂萃取5 min,循环萃取2次,将萃取液定容过滤后,用配置二极管阵列检测器的UPLC进行分析。此方法具有分离效率高、分析时间短、检测灵敏的优点。应用此方法对18种单料烟和14种成品卷烟中的6种多酚成分进行了测定。结果表明:①不论是在单料烟叶还是成品卷烟中,绿原酸和芸香苷的含量均占多酚总量的90%以上;②在单料烟叶中,烤烟中多酚的含量高于白肋烟和晒烟;③不同部位的烤烟中,多酚含量从上部、中部和下部依次降低,这表明多酚成分可成为烟叶等级判别和质量控制的化学指标之一;④烤烟型卷烟中多酚的含量显著高于混合型卷烟中多酚的含量。       

烟草DELLA基因家族的克隆与表达模式分析

为明确烟草受逆境胁迫时DELLA基因家族的转录调节功能,通过烟草EST序列比对分析克隆了3个DELLA基因家族基因（NtDELLA1,NtDELLA2,NtDELLA3）,并对3个基因的结构和表达模式进行了分析。生物信息学分析结果表明,烟草DELLA基因全长1 700 bp左右,其编码蛋白包含DELLA蛋白的特征结构域DELLA基序和VHYNP基序,与拟南芥DELLA蛋白家族的GAI蛋白高度同源,推测烟草DELLA蛋白与拟南芥DELLA蛋白具有类似的功能;荧光定量PCR分析结果表明,这3个基因在烟草不同组织和关键生长发育时期表达模式类似,尤以茎中表达量最高;胁迫应答分析结果表明,烟草DELLA基因的转录对干旱、低温、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）侵染和外源激素均表现出不同程度的响应,其中干旱、赤霉素（GA）和脱落酸（ABA）可抑制烟草DELLA基因的表达,而低温胁迫可诱导NtDELLA1上调表达,TMV侵染可诱导NtDELLA1和NtDELLA2的大量表达。      

超声波强化酶法合成L-抗坏血酸癸酸酯及其抗氧化性研究

研究了在超声波场中以固定化脂肪酶（Novozym^ 435）为催化剂,在叔丁醇中合成L-抗坏血酸癸酸酯。超声波可以显著加速底物的溶解,并使反应时间由48h缩短到4h,产率可达到78.48%,产物纯度为98.6%,超声波处理下固定化脂肪酶可重复利用的次数为4次。抗氧化实验结果表明在一定质量浓度范围内,L-抗坏血酸癸酸酯具有很强的还原力、清除羟自由基、DPPH自由基能力能力,在等质量浓度下与L-抗坏血酸棕榈酸酯相当,且前两个指标优于TBHQ;将L-抗坏血酸癸酸酯添加到油脂中,其抗氧化能力也较优,说明L-抗坏血酸癸酸酯是一种很有潜力的抗氧化剂。      

双歧醋麸曲种曲的制备及活力检测

以双歧杆菌、米曲霉、黑曲霉共同发酵的方法制备双歧醋麸曲的种曲,测定其活力以检验种曲的性能,并测定双歧杆菌含量以确定双歧杆菌能否在种曲中存活.将米曲霉和黑曲霉按比例1:1接种到麸曲中,同时加入1000μL双歧杆菌,经过培养,摇瓶,扣瓶培养,得到种曲曲饼,再将其粉碎装袋干燥后,测定双歧醋麸曲种曲水分64.9%,酸度0.288mL/g,糖化力1188.8U/g,液化力9.6U/g,蛋白质分解力23.3μg/(min·g),双歧杆菌存活数1.5×103cfu/g.