古细菌Pyrococcus furiosus嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从嗜热古细菌Pyrococcusfuriosus的基因组DNA中扩增出胞外α 淀粉酶完整结构基因 ,插入表达载体pET2 8a中构建成质粒 pET amy(sig+) ,以质粒pET amy(sig +)为底物扩增出不含信号序列的α 淀粉酶成熟肽基因片断 ,获得质粒 pET amy(sig ) ,将重组质粒分别转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)。在T7启动子和lac操纵子控制下 ,通过IPTG的诱导在重组大肠杆菌细胞内分别表达出含信号肽和不含信号肽的融合蛋白。其中不含信号肽的融合蛋白具有与P .furio sus产生的胞外α 淀粉酶相似的酶学性质 :最适pH为 5 .0 ,最适温度约为 95℃ ,在 1 2 1℃下热处理 1h酶活仍能保持 50 %以上 ;含信号肽序列的基因的表达产物不能测到酶活     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及其产物的分泌

以耐高温α 淀粉酶生产菌地衣芽孢杆菌染色体DNA为模板 ,通过PCR扩增耐高温α 淀粉酶基因 ,将扩增产物 1 9kb的DNA片段插入到pUC1 9质粒中 ,再转化大肠杆菌JM1 0 9,通过在淀粉平板上形成透明圈等方法筛选到一株阳性克隆菌株JM1 0 9(pUAM) ,其表达产物可分泌到培养基中 ,除去菌体的发酵液中每 1 0 0mL酶活可达到 2 7个单位。将发酵上清液浓缩后用冷无水乙醇分级沉淀 ,所得样品进行SDS PAGE分析 ,得到分子质量为 60ku的目的蛋白带。     

α-淀粉酶的耐酸性改造及在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

α-淀粉酶基因经改造后,克隆到穿梭质粒pBE2中。在α-淀粉酶基因的上游连接枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR),构建了含突变α-淀粉酶基因的分泌型诱导表达载体pBSAT,转化蛋白酶三缺陷枯草芽孢杆菌菌株DB403。含有pBSAT的菌株可将突变α-淀粉酶分泌到胞外,表明sacB基因的启动子-信号肽序列(sacR)能很好的将枯草芽孢杆菌中的重组α-淀粉酶引导到胞外,完成分泌表达。分泌的α-淀粉酶具有较高的耐酸性及生物学活性。     

极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

为探索极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WB600）中的高效分泌表达条件,对来源于枯草芽孢杆菌的9?种Sec分泌途径信号肽进行筛选,结果显示信号肽YfkN的引导分泌效率最高。在此基础上,为进一步优化PFA的分泌表达,对信号肽YfkN的Ile3和Gln4进行饱和突变,并比较不同突变体的引导分泌效率。结果表明突变体I3G/Q4R的引导分泌效率最高,重组枯草芽孢杆菌的胞外α-淀粉酶活力高达715?U/mL。重组α-淀粉酶PFA的最适反应pH值为5.0,最适反应温度为100?℃,于100?℃的半衰期长达13?h,并且不依赖于Ca2＋。结果表明,采用信号肽I3G/Q4R,极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达,这有利于其在淀粉液化工艺中的应用。     

地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达

用PCR方法从地衣芽孢杆菌中扩增了耐高温α淀粉酶基因,将扩增的DNA片段插入到大肠杆菌载体pUC19中,构建重组分泌型表达载体pUAM。pUAM中的耐高温α淀粉酶基因在大肠杆菌JM109中得到表达。经SDSPAGE分析显示,蛋白表达产物的分子量为55ku,同核酸序列测定所推导的值相符。     

嗜热古菌高温酸性淀粉酶基因合成和大肠杆菌中的表达

BD5088是来源于1种嗜热球菌Thermococcus sp.的高温酸性α-淀粉酶的人工突变体,研究中根据BD5088基因的氨基酸序列,经密码子优化,用2步PCR法合成去信号肽后的成熟肽基因。该基因全长1311bp,由436个氨基酸组成。现将其克隆到大肠杆菌的表达载体pET30a上,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达出的目的蛋白分子量约为48ku,大小与理论值一致,经过Ni+树脂纯化,得到纯化后的重组酶BD5088。重组α-淀粉酶BD5088具有α-淀粉酶的活性,最适反应温度范围为70～85°C,最适反应pH值为5.6～6.0,在100℃下酶活性半衰期约30min。活性不依赖于Ca2+。本研究为该基因在毕赤酵母中的表达和基因的定向进化改造打下了基础。     

大麦β-淀粉酶基因在大肠杆菌中的异源表达

大麦来源的β-淀粉酶具有稳定性高和工业应用效果好的优点,被广泛应用于食品、酿造以及粮食加工,但是其制备成本高,价格较昂贵。该研究使用大肠杆菌异源表达大麦来源的β-淀粉酶。首先通过基因合成技术获得密码子优化的大麦来源的β-淀粉酶基因,将该基因通过质粒p ET28a(+)在大肠杆菌BL21(DE3)中过量表达获得重组β-淀粉酶。其次,对重组表达的β-淀粉酶和大麦中直接提取的β-淀粉酶进行酶学性质比较分析。结果表明,重组表达的β-淀粉酶其分子质量大小与大麦中β-淀粉酶一致,即59 k Da,重组的β-淀粉酶比酶活由大麦来源的588 U/mg降为285.5 U/mg,最适作用温度降低了10℃,最适p H保持一致。所以,大麦β-淀粉酶能够在细菌中高效表达,但是其酶学性质发生较大改变。     

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

酸性α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现酸性α-淀粉酶基因的高效表达,将本实验室已经克隆得到的去信号肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌WB600宿主中进行表达,成功的构建了表达菌株pHT43-amy/WB600。在初始菌浓度OD600为0.8时加入终浓度为0.9 mmol/L的IPTG,诱导6 h的条件下测得酶活力为1 230 U/mL,又由于宿主菌WB600外分泌蛋白较少,因此具有明显的生产优势。     

米根霉α-淀粉酶基因的克隆与表达

以博德研究公布的米根霉基因组信息为基础设计引物,分别从两株米根霉中克隆得到大小为1 386 bp的α-淀粉酶编码基因。通过比对分析发现该淀粉酶基因内部不含内含子,两条基因的相似度为95.54%,基因编码产物相似度为97.84%。基因编码产物属于淀粉酶家族13成员,具有淀粉酶家族所特有的4个典型的高度保守区域。以质粒载体pET-28a(+)为基础构建相关表达载体,实现了两个淀粉酶在E coli中的功能性表达。两个淀粉酶在E coliBL21(DE3)codon-Plus宿主中的表达量相对较高,分别为1.3 U/mL和0.5 U/mL。其中一个淀粉酶经Ni亲和柱纯化后,用于进行(马铃薯)淀粉水解实验,终产物中葡萄糖质量浓度约为10 g/dL,麦芽糖质量浓度约为74 g/dL,其它低聚糖含量较少。     

组成型分泌表达嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶的重组粪肠球菌的构建

该研究以高效组成型启动子P10替换pSIP401-gtamyhds中诱导型启动子,构建重组载体pSIP401Z-gtamyhds,并以其为基础框架,分别导入粪肠球菌（Enterococcus faecalis）来源的8种信号肽（s1～s8）,采用电转化法将信号肽筛选载体转入具有优良益生特性的粪肠球菌EXW27,构建组成型分泌表达嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的重组粪肠球菌。以发酵上清液中α-淀粉酶活性为评价指标,对8种信号肽进行筛选,并对嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy进行分离纯化和酶学性质研究。结果表明,信号肽s7对嗜热酸性生淀粉α-淀粉酶Gt-amy的分泌效率最高,发酵上清液中α-淀粉酶活性达到310 U/mL。重组Gt-amy的最适反应pH值为5.0,在pH 4.0～8.0范围内具有较好的稳定性,最适反应温度为80 ℃,于80 ℃的半衰期为3 h,在40 ℃条件下反应3 h,对玉米淀粉的降解率可达55.8%。     

耐高温α-淀粉酶基因改造研究进展

耐高温α-淀粉酶是重要的工业用酶制剂之一,主要介绍耐高温α-淀粉酶的基因改造研究进展.     

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用表达载体pET-30a,实现了去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd及未突变的高温α-淀粉酶基因amy在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达。经多步纯化,重组酶AMY及AMYD的比活分别达到312.7U/mg蛋白和354.6U/mg蛋白,纯化倍数分别为75.90和83.83,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,AMY及AMYD酶分子质量均为63.5ku。重组酶AMY的最适温度80℃,最适反应pH为6.5,在温度低于90℃,反应pH5.5~7时,酶活较稳定。重组酶AMYD的最适温度80℃,最适反应pH为4.5,在温度低于90℃,反应pH4.0~6.5时,酶活较稳定。     

耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化

通过摇瓶实验对产耐高温α-淀粉酶的重组菌E.coli BL21的高密度高表达发酵条件进行研究。考察不同培养基和不同发酵条件对该菌株产耐高温α-淀粉酶的影响,并利用正交试验进行优化。结果表明:在葡萄糖0.5g/L,酵母粉15g/L,pH6.5,诱导时机为接种后发酵4h,诱导时间为6h,IPTG添加量为0.8mmol/L,接种量为体积分数3%的优化条件下,该重组菌发酵液菌体生物量为原来的1.29倍,酶活力达到8.754U/mL,是原来的1.55倍,目的蛋白的表达量也为原来的1.24倍。     

Sulfolobus tokodaii strain 7高温酸性α-淀粉酶基因在大肠杆菌中克隆表达及其酶学性质

以超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain 7基因组DNA为模板,通过PCR扩增高温酸性α-淀粉酶基因ST0817,将此基因克隆至表达载体pET15b,并转化大肠杆菌Escherichia coli BL21-CodenPlus(DE3)-RIL,获得重组大肠杆菌工程菌。通过热处理、镍柱亲和层析和分子筛层析,得到纯化重组酶,SDS-PAGE分析表明,该酶分子量为53.0 kDa。酶学性质研究表明,该酶最适温度和pH分别为75℃和5.5;具有较强的热稳定性和pH稳定性,在85℃处理8 h保持50%左右活力,在pH 5.2处理120 min仍保持50%活力。此酶对不同底物水解活性不同,直连淀粉>可溶性淀粉>支链淀粉>β-极限糊精>糖原>环糊精>普鲁兰糖;该酶对有机溶剂、变性剂和金属离子具有一定抗性。     

N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶ApkA酶学性质的影响

为探索N-糖基化修饰对极端嗜热酸性α-淀粉酶Apk A酶学性质的影响,同时为构建酵母工程菌奠定基础,将Apk A缺失信号肽突变体Apk Ads及含有2个潜在N-糖基化修饰位点的突变体Apk Ads D182N/G373S在毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中进行表达。Apk Ads和Apk Ads D182N/G373S在Pichia pastoris GS115中大量表达并分泌到胞外,Apk Ads的表观分子质量约为45 k D,Apk Ads D182N/G373S的表观分子质量约为55 k D。酶学性质分析表明,与Apk Ads相比,Apk Ads D182N/G373S的酶学性质发生了一定的变化。其最适反应p H值由6.5降低至5.5~6.0,酸性条件下稳定性增强;最适反应温度由90℃提高至100℃;于90℃的半衰期由5 h增加至5.5 h,于100℃保温10 min后的相对酶活力由32.03%增加至49.04%。结果表明N-糖基化修饰可适当提高Apk A的酸性条件下酶活力和稳定性、最适反应温度、热稳定性。突变体Apk Ads D182N/G373S的酶学性质使其适于淀粉液化工艺的应用。     

α-淀粉酶在不同地衣芽孢杆菌宿主菌中分泌表达的对比分析

研究不同地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主菌对α-淀粉酶分泌表达的影响。以Bacillus subtilis的P43启动子,B.licheniformis WX-02α-淀粉酶基因的信号肽、编码区和终止子序列为表达原件,构建了α-淀粉酶分泌表达载体pP43SAT。将pP43SAT分别转入3株B.licheniformis宿主菌:WX-02(ΔamyL)、BL9和BL10,获得3株α-淀粉酶基因工程菌WX-02(ΔamyL,pP43SAT)、BL9(pP43SAT)和BL10(pP43SAT),并将构建的3株工程菌进行发酵对比分析。BL9(pP43SAT)和BL10(pP43SAT)的淀粉酶发酵活力分别达到94.01 U/mL和101.94 U/mL,比原始宿主菌WX-02(ΔamyL,pP43SAT)分别提高了21%和31%,这说明BL9和BL10新型宿主菌有利于淀粉酶的分泌表达。本研究证明多蛋白酶基因缺失可显著提高α-淀粉酶的表达,为α-淀粉酶的高效表达提供了新型宿主菌和新策略。     

芽胞杆菌XM-1酸性α-淀粉酶基因的克隆及原核表达

为使枯草芽胞杆菌XM-1菌株酸性α-淀粉酶基因高通量表达,提高酶产量,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出该酶基因As-Amy,并构建pET30a(+)/As-Amy原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功表达。测序结果表明As-Amy基因编码框全长为1434bp(Genbank登录号GQ153530),编码477个氨基酸,预测蛋白质分子质量为61ku。序列比对分析表明,As-Amy与多个枯草芽胞杆菌α-淀粉酶基因相似性在98%以上,所编码氨基酸与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)IAM1212同源性最高。SDS-PAGE分析显示,As-Amy基因在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活力较原菌株XM-1提高了2.7倍,表达蛋白分子质量大小与预测值相符。     

嗜热α-淀粉酶热稳定性的决定因素及提高策略

阐明了嗜热α-淀粉酶的微生物来源及性质,分析了影响嗜热α-淀粉酶热稳定性的8种因素,提出采用物理法、化学法和生物法提高嗜热α-淀粉酶热稳定性的策划,为完善α-淀粉酶的热稳定化技术提供了参考依据。     

α-淀粉酶的基因改造与菌种选育研究进展

α-淀粉酶是重要的工业用酶制剂之一,能在高温、低pH范围内稳定发挥作用的α-淀粉酶则具有更加广阔的应用前景。本文主要从基因改造与菌种选育两方面阐述了高温α-淀粉酶、酸性α-淀粉酶以及高温酸性α-淀粉酶的研究与开发进展。