多重重组酶介导等温扩增技术检测食品中3种食源性致病菌

建立快速、灵敏的多重重组酶介导等温扩增方法（recombinase aided amplification,RAA）同时检测食品中的大肠埃希氏菌O157:H7、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。方法 根据大肠埃希氏菌O157:H7的rfbE基因、沙门氏菌的invA基因以及金黄色葡萄球菌的nuc基因的序列保守区域设计RAA特异性引物,筛选出最优的引物组合并优化各项实验条件;通过标准菌株验证方法特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,验证方法在实际食品样本中的检测能力。结果 多重RAA方法最佳扩增温度为37℃,反应时间为50 min;方法特异性良好,仅对目标菌株存在特异性扩增条带,与其他常见食源性致病菌无交叉反应;方法对基因组DNA的检测灵敏度为0.10 ng/μL;方法对经过简单增菌的人工污染牛奶样本和牛肉干样本中目标菌株的检出限为100 CFU/mL。结论 本研究建立的多重RAA扩增方法具有特异性好、灵敏度高、检测通量高等优势,适用于多种场景下食品样本中3种食源性致病菌的快速检测。     

草莓中诺如病毒和甲肝病毒的多重实时荧光逆转录PCR检测方法的建立

目的建立草莓中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒等3种食源性病毒的多重实时荧光RT-PCR检测方法,并应用于实际样品检测。方法对草莓样品进行前处理、病毒富集、病毒RNA提取和纯化后,先采用单重实时荧光RT-PCR进行检测,随后进行多重实时荧光RT-PCR反应条件优化,建立多重实时荧光RT-PCR检测方法并分析其特异性和灵敏度。结果所采用的病毒富集和核酸提取方法可以实现病毒的有效富集和抑制剂的去除,建立的多重实时荧光RT-PCR方法特异性强(100%),对草莓样品中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒的检测灵敏度分别为56.2 RT-PCR50/20 g、31.6 RT-PCR50/20 g和31.4 CCID50/20 g。同时对50份样品进行检测,结果均为阴性。结论所建立的检测方法快速、灵敏、特异性强,适用于草莓产品中诺如病毒GI、诺如病毒GII和甲肝病毒的同时检测。     

重组酶等温扩增技术快速检测对虾中的白斑综合征病毒

摘 要: 目的 针对对虾中白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV),分别建立基于国外专利技术的重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification, RPA)方法,基于国内专利技术的重组酶介导等温扩增法(Recombinase-aided amplification, RAA) 方法,并对两种方法进行比较。方法 应用重组酶等温扩增技术在恒温(39℃)条件下完成扩增反应的优势, 调整反应体系中模板DNA和探针浓度, 优化WSSV病毒RPA和RAA两种方法的反应体系, 建立了可靠稳定的等温扩增RPA和RAA快速检测方法,比较了两种方法的特异性、灵敏度、扩增效率和稳定性。。结果 所建立的荧光RPA和RAA方法在恒温39 ℃的条件下特异性检测WSSV, 检测构建质粒DNA的灵敏度可达到1.0×106 copies/μL, 检测实际感染阳性样品的灵敏度可达到1.31×101 pg/μL; RPA方法的扩增线性曲线拟合度R2=0.9970, 扩增效率为 98.50%;RAA方法的扩增线性曲线拟合度R2=0.9910, 扩增效率为 98.50%。 结论 所建立的基于重组酶等温扩增技术的RPA和RAA方法,特异性好,对于质粒和阳性样品检测灵敏度一致,扩增效率一致,具有很好稳定性。适用于水产品养殖及生产加工和通关口岸进口虾类产品中WSSV病毒的现场快速筛查防控。     

基于荧光探针重组酶介导等温扩增技术快速检测食源性单增李斯特菌方法的建立

目的：建立一种基于荧光探针重组酶介导等温核酸扩增(Recombinant Enzyme Mediated Isothermal Nucleic Acid Amplification,RAA)技术的快速检测食源性单增李斯特菌的方法。方法：针对单增李斯特菌hlyA基因的保守序列设计特异性引物和探针,通过构建含hlyA靶基因片段的重组质粒和不同浓度单增李斯特菌核酸,评价其灵敏度;通过检测大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等菌液核酸,评价其特异性。结果：所建立的荧光RAA法可在39℃、20 min内完成样本核酸的检测。采用所建立的方法对质粒和核酸进行检测,质粒最低检出限为1 copy/μL,菌液核酸最低检测限为103 CFU·mL^-1,且与其他菌株核酸无交叉反应。结论：成功建立了一种基于荧光RAA法的单增李斯特菌核酸检测方法,该方法具有特异性强和快速的特点,可用于疑似污染单增李斯特菌食品的快速检测。     

沙门氏菌ERA可视化快速检测方法的建立

为实现食品中沙门氏菌的快速检测，选用文献报道的沙门氏菌RPA引物和探针，建立酶促等温扩增(ERA)荧光法和显色法两种沙门氏菌可视化快速检测方法，并分析两种方法的特异性、灵敏度、检出限等指标。同时，为满足实验室外现场检测环境的要求，分别采用自热包和热帖作为现场DNA提取和ERA反应的热源，建立不依赖实验室设备的方法。优化后两种ERA方法检测时间分别为11 min和4 min，灵敏度均可达10^-2 ng/μL，人工污染样品增菌培养4 h后检出限为1CFU/mL。本研究创新性地将沙门氏菌RPA引物探针应用到ERA检测体系，建立了荧光法和显色法两种可视化快速检测方法，并集成现场DNA提取和ERA反应检测套组，提高了扩增效率，摆脱了对传统实验室设备的依赖，对于推进食源性致病菌现场可视化快速检测具有重要意义。     

重组酶介导等温扩增法检测食品中铜绿假单胞菌

目的 建立重组酶介导等温扩增（Recombinase-aided amplification,RAA）法,快速、灵敏、特异检测食品中铜绿假单胞菌的分析方法。方法 针对铜绿假单胞菌lasB基因的特异性保守区域,设计RAA特异性引物和exo探针,筛选出最优组合;对提取的目标基因组DNA进行检测,确定方法的特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,比对不同检测方法对食品样品的检出限。结果 建立的铜绿假单胞菌lasB基因RAA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有扩增曲线,对其他致病菌无交叉反应;方法对纯菌液的灵敏度为1.7 pg/μL。人工污染实验表明,方法对肉类样品中铜绿假单胞菌的检出限与传统方法一致,达1.0×103 CFU/mL;RAA方法检测时间仅需20min。结论 本研究建立的铜绿假单胞菌实时荧光RAA检测方法特异性强、灵敏度高、反应时间短,可用于食品中铜绿假单胞菌的快速检测。     

重组酶介导的等温扩增技术联合CRISPR-Cas13a快速检测4种腹泻病原菌

目的重组酶介导的等温扩增技术(RAA)联合规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a),建立对沙门菌、志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7 4种腹泻病原菌的快速分子检测方法,即RAA-Cas13a。方法 设计4种腹泻病原菌的RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a恒温荧光检测,以实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)为对照方法,评价RAA-Cas13a优化方法的灵敏度与特异性。结果 RAA-Cas13a方法可在35 min内完成检测。检测志贺菌、霍乱弧菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7的最低检测限为10 copies/μL,沙门菌最低检测限为1 copy/μL;特异性实验表明每一种病原菌与其余10种对照细菌均无交叉反应。应用建立的方法检测200份实际样本和40份人工污染样本,结果表明同RT-qPCR检测结果一致性高(分别为Kappa=0.927和Kappa=1.000)。结论 RAA-Cas13a检测方法具有灵敏度高,特异性强等优点,能用于4种腹泻病原菌的快速检...     

蓝莓中诺如病毒检测方法的优化及其在果蔬中的应用

目的:建立蓝莓等浆果类和蔬菜类食品中GII型诺如病毒(NoV GII)的有效检测方法。方法:利用已知NoV GII病毒样本对阴性的蓝莓进行人工染毒,分别比较7种洗脱液和2种浓缩方法的回收效果,优化RNA提取方法,最后采用荧光定量PCR方法进行检测。用新建立的诺如病毒浓缩检测方法,对7种市购浆果和蔬菜样品进行检测并研究其最低检出限。结果:实时荧光RT-PCR检测结果表明,人工染毒后的蓝莓等浆果样品(表皮和基质)采用TP ALK洗脱液洗脱,经酶处理后超滤法浓缩,最后采用病毒核酸提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)提取浓缩病毒的RNA,诺如病毒的回收效率达到较高的水平,其灵敏度达3.5～350 PCRU/10g。将该方法用于草莓、杨梅、葡萄、小番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜等7种水果蔬菜中诺如病毒的检测,其中杨梅和小番茄的检测灵敏度达到3.5～3 500 PCRU/10 g,草莓、生菜和胡萝卜次之,为35～35 000 PCRU/10 g,黄瓜和葡萄的灵敏度较低。结论:所建立的果蔬中诺如病毒富集方法和核酸提取方法操作简便,灵敏度较高,适合于蓝莓等浆果和蔬菜类样品中NoV GII的检测。     

曲虫治理效果分析

通过对曲虫治理应用研究效果的分析 ,结果表明 :质量效果提高 7% ,糖化力效果提高 80 % ,综合效果提高 92 7%。     

分离高温盐的工艺条件研究

文章利用不同温度下Na ,K ∥Cl-,SO2 -4 —H2 O四元体系相图 ,对通过物理方法分离高温盐中一水硫酸镁和氯化钠的工艺条件进行了分析。得出当循环母液和高温盐配成的浆料温度超过 5 5℃ ,浆料液体中氯化镁达到一定浓度时 ,才能分离出纯净的一水硫酸镁和氯化钠。     

制革清洁化技术的进展

就皮化材料与清洁化制革的关系、目前传统制革工艺中存在的严重污染问题及针对这些问题近年来采取的新的方法进行了探讨,指出清洁化是我国制革行业的必由之路,清洁化制革工艺与皮化材料的关系非常密切,只有研发出相应新型的、高吸收的、功能型的、易降解型的各类化工材料,才合乎清洁化生产的要求。在制革工艺中采用生物酶制剂辅助浸水脱脂、无硫脱毛与无灰浸碱工艺、无铵脱灰/碱等改造传统工艺,减少污染;采取高吸收铬鞣、无铬或少铬鞣制,提高铬的吸收率或克服铬鞣的弊端;在染整中,合成并采用助剂辅助染料、复鞣剂和加脂剂等的吸收与结合。这几方面通过集成应用,方可减轻制革的污染,实现清洁化生产。同时,就皮革固废物的利用及水的循环使用问题提出些看法。     

核苷酸磷酸基团保护的研究

将谷氨酸钠、5′－磷酸鸟苷按1：1混合后，添加柠檬酸，然后用硬脂酸包覆，能够有效地保护核苷酸5′－位上的磷酸基团。其中，（5′－磷酸鸟苷＋谷氨酸钠）：柠檬酸：硬脂酸＝30.3:9.1:60.6时，5′－磷酸鸟苷的残存率可达93％。     

葵花籽油中酸价测量结果的不确定度评价

目的 分析食用油中酸价测定的不确定度来源并建立不确定度评定方法, 为检验数据的可靠性和准确性提供参考。方法 依据GB 5009.229-2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》和JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》建立数学模型, 计算各变量的不确定度, 最终计算扩展不确定度。结果 结果显示, 样品中酸价的扩展不确定度为U=1.764×10?3 mg/g, 样品中酸价含量为(0.16±0.002) mg/g(置信水平95%, 包含因子k=2)。结论 在测定过程中, 测量重复性对总的不确定度影响最大, 其次是滴定管的体积。     

有梭织机稀密路织疵成因分析

从有梭织机打纬过程中织机构件的位置和状况对纬纱之间距离的影响出发,推导出纬向密度计算公式,直观分析了影响纬向密度的各种因素,提出了为减少稀密路织疵在国产老织机上采取的几项改进措施：采用弹簧回综、机外送经、电子驱动、导布辊加压等装置。     

The basis streamlines of activities of Department of Preventive Medicine of RAMS

The article gives a brief account of the main streamlines and scope of scientific activities of Department of Preventive Medicine of RAMS for the recent 10 years.     

两种脂肪酸聚甘油酯(PGE)的性质比较

脂肪酸聚甘油酯(Polyglycerol esters of fatty acids,简写为PGE)在常温下有半固态和固态两种存在状态,本文通过对分别添加这两种PGE的软冰淇淋基料进行粘度、pH、粒径分析和垂直扫描分散稳定性分析(Turbiscan),发现半固态PGE的添加量为0.2%时,乳状液的粘度最低,粒径最小,稳定性最好;固态PGE的添加量为0.4%时.乳状液的粘度最低,粒径最小.通过比较发现,两种PGE对基料的影响有很大差别:半固态PGE能使乳状液的粒子更小,并能有效延长乳状液的稳定性;而固态PGE由于其熔点较高,可以促进脂肪结晶.     

酶水解猪皮胶原的色谱分离研究

比较详细地描述了用现代色谱分离的试验方法.用本实验室自制的弱阳离子交换树脂将猪皮胶原的酶水解产物成功地分离为5个组分,并详细讨论了影响分离效果的各种因素,确定了最佳分离条件.