凡纳滨对虾抗菌肽的筛选及与DNA的结合机制

探究凡纳滨对虾中一种新型抗菌肽PV13对副溶血性弧菌的抑菌活性及与DNA的结合机制。采用超高效液相色谱-质谱联用技术鉴定凡纳滨对虾体内小分子多肽序列,并采用生物信息学从序列库中分析、筛选得到阳离子抗菌肽PV13(ALPWVLPWALPRALPRVLPR)。通过最低抑菌浓度(MIC)和时间杀伤曲线(Time-kill)测定抗菌肽PV13对副溶血性弧菌的MIC为62.5 μg/mL,可在2 h内将副溶血性弧菌全部杀灭。采用透射电子显微镜观察、细胞内膜通透性测定、DNA凝胶阻滞和圆二色谱仪等评价抗菌肽对副溶血性弧菌的抑菌机制。结果表明,抗菌肽PV13能增加副溶血性弧菌细胞膜内膜的通透性,使得细胞膜变薄,从而进入细胞,与基因组DNA结合来体现其抑菌活性,二者结合程度与肽浓度呈正相关。抗菌肽PV13在PBS和SDS溶液中均呈无规则卷曲结构,与副溶血性弧菌基因组DNA结合后,色谱吸收峰发生明显变化。推测序列中4个重复的亮氨酸-脯氨酸区域可能是其抑菌活性功能域。上述结果对凡纳滨对虾中抗菌肽的筛选及其分子设计具有指导意义,同时也为抗菌肽PV13作为食品新型防腐剂的应用提供理论支持。     

几种天然食用成分对副溶血性弧菌抑菌作用研究

副溶血性弧菌是引起我国特别是沿海地区细菌性食物中毒危害的首要食源性致病菌。本实验通过单因素试验和正交试验研究醋酸、酒精与茶多酚3 种天然食用成分对菌悬液中副溶血性弧菌存活率的影响。单因素试验结果表明：经体积分数高于50%酒精或质量浓度为0.5mg/mL的茶多酚处理5min能完全杀灭菌悬液中的副溶血性弧菌;经pH2 的醋酸溶液处理也能使菌悬液中副溶血性弧菌降低4.79lg(CFU/mL)。正交试验结果表明：酒精体积分数、茶多酚质量浓度和酸度对副溶血性弧菌的抑制效果具有明显的协同作用;pH2.8、酒精体积分数20% 及茶多酚质量浓度0.125mg/mL 或pH2.4、酒精体积分数12% 及茶多酚质量浓度0.125mg/mL 的混合体系均能有效抑制副溶血性弧菌的生长。这些研究结果说明食用酒精、醋酸和茶叶提取物的适当配合将有可能作为复合杀菌剂用于水产食品中,从而降低副溶血性弧菌感染的风险。     

盐渍凡纳滨对虾抗菌肽PV-M7对副溶血性弧菌的抑菌活性

抗菌肽是食品工业的新型生物防腐剂,而盐渍发酵食品是抗菌肽的来源之一。采用超高效液相色谱-质谱联用技术从盐渍凡纳滨对虾中鉴定小分子多肽序列,利用生物信息学分析筛选潜在的抗菌肽。通过最低抑菌浓度、时间-杀灭曲线、细胞膜通透性和圆二色谱等试验评价抗菌肽对副溶血性弧菌的抑菌活性及机制。结果表明:盐渍凡纳滨对虾中一种新型抗菌肽(PV-M7)对副溶血性弧菌的最低抑菌质量浓度为15.6 μg/mL,其在1 h内即可产生很好的抑菌作用。PV-M7作用于副溶血性弧菌后,可使细胞膜通透性增加,胞内大分子物质(核酸、蛋白质)泄露,同时,细胞膜表面模糊,细胞质密度减小。当PV-M7接触细胞膜时,它的二级结构由无规则卷曲转变成α-螺旋,这种结构转换是其发挥抑菌活性的关键作用机制。     

光动力技术对副溶血性弧菌的灭活作用

该文探究了姜黄素介导的光动力技术(photodynamic technology, PDT)协同柠檬酸处理对副溶血性弧菌的灭活效果和机理。通过平板菌落计数法测定光动力技术对副溶血性弧菌的灭活效果、扫描电镜观察细菌形态变化,酶标仪检测PDT处理后菌体活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平以及过氧化氢酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatase, ATPase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)的活性变化,琼脂糖凝胶电泳分析基因损伤程度。结果表明,PDT杀菌效果随姜黄素浓度增加、光照时间延长和柠檬酸(0.5 mg/mL)的添加而显著增强(在最高浓度姜黄素条件下P<0.05)。当姜黄素浓度为2μmol/L,柠檬酸质量浓度为0.5 mg/mL,光照2 min后,PBS中的副溶血性弧菌菌落总数从7.43 lg CFU/mL降至0。光敏剂姜黄素被蓝光激活后通过电子转移和能量转移产生具有强氧化性的ROS,菌体内...     

抑制副溶血性弧菌的乳酸菌筛选鉴定及其生物学特性研究

目的:丰富功能性乳酸菌资源库，寻找具有副溶血性弧菌拮抗能力的优良乳酸菌出发菌株。方法:采用牛津杯抑菌试验筛选具有广谱抑菌潜力的乳酸菌菌株，通过生长代谢性能、胃肠液耐受性能、耐盐性、抗生素敏感性、抑菌谱等指标探讨其生物学特性。结果:以副溶血性弧菌为指示菌，筛选得到6株乳酸菌，经形态学、生理生化、分子生物学鉴定，分别归类于类干酪乳酪杆菌、发酵黏液乳杆菌和植物乳植物杆菌。其中，类干酪乳酪杆菌A1抑菌活性最佳，24 h内菌落总数超过1×10⁹ CFU/mL,发酵液pH值稳定在4.1左右，经人工模拟胃液处理2 h后，存活率为54.61%,再经人工模拟肠液处理8 h后，存活率仍可达45.46%,经10%NaCl胁迫处理24 h后，活菌总数>1×10⁵ CFU/mL。同时，类干酪乳酪杆菌A1细菌素粗提物对13种致病菌呈良好抑菌活性，具有广谱抑菌潜力，且对8种常见抗生素未见耐药性。结论:筛选得到了能够抑制副溶血性弧菌且生物学特性优良的类干酪乳酪杆菌A1。     

纳米免疫磁分离-实时荧光聚合酶链式反应快速检测海产品中副溶血性弧菌

采用副溶血性弧菌单克隆抗体、纳米免疫磁分离技术,结合实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,建立海产品中副溶血性弧菌纳米免疫磁分离-实时荧光PCR检测方法。副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为103 CFU/mL水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。在纯培养、无需增菌情况下,该方法检测灵敏度达到140 CFU/mL;通过134 株副溶血性弧菌和74 株非目标菌的测试,实时荧光PCR技术具有良好的特异性;在食品基质添加实验中,其检测限为2 CFU/25 g样品,增菌时间缩短到8 h。     

反式肉桂醛对副溶血性弧菌的抑制作用

本研究通过测定TC对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)评价其抑菌效果;随后通过测定TC对副溶血性弧菌生长曲线、生长动力模型、细胞膜完整性及细胞形态的影响探究其可能的抑菌机理;最后,构建副溶血型弧菌污染的鲜虾模型,评价TC对鲜虾中副溶血性弧菌的控制作用。结果表明,TC对副溶血性弧菌的MIC为50～70μg/mL;TC可降低副溶血性弧菌最大生长速率、延长其生长延滞期;TC可使副溶血性弧菌细胞膜完整性显著降低,并使副溶血性弧菌细胞形态干瘪、皱缩;在鲜虾模型中,体积分数0.4%的TC在1 h(4℃)使鲜虾中的副溶血性弧菌降低至检出限以下。研究结果表明,TC有潜力作为天然的抗菌物质应用于鲜虾及其他海产品中有效控制副溶血性弧菌。     

四川家庭自制菜与餐饮洗澡泡菜在腌制过程中的品质变化

通过对四川家庭自制泡菜和餐饮用洗澡泡菜在腌制过程中的乳酸菌数与细菌数、亚硝酸盐含量、总酸含量进行同步分析,以及感官评分与总酸含量、硬度、盐度进行同步分析,结果表明:家庭自制泡菜在室温(10℃~20℃)条件下腌制第2天为最佳食用期,总酸含量为12.41 mg/g,盐度为3.24 g/100 g,硬度为3543.8 g,感官评分达到最高值94.58,且乳酸菌数达到最高值26.47lg CFU/mL,乳酸菌数极显著高于细菌数成为优势菌群(p﹤0.01);腌制第3天,细菌数下降至最低值11.23 lg CFU/mL,亚硝酸盐含量达到最低值13.43 mg/kg,低于国家标准限量要求。餐饮用洗澡泡菜在室温(10℃~20℃)条件下腌制第24小时为最佳食用期,总酸含量为6.48 mg/g,盐度为2.51g/100 g,硬度为3885.4 g,感官评分达到最高值84.43;腌制第36小时,乳酸菌数达到最高值9.51 lg CFU/m L,细菌数降至最低值17.43 lg CFU/mL,亚硝酸盐含量降至最低值20.76 mg/kg,以上3个指标与家庭自制泡菜差异极显著(p﹤0.01)。实验结果提示乳酸菌菌群对四川泡菜腌制过程中产品品质形成和安全性保障具有决定性作用。     

副溶血性弧菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立

以副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)gyr B基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence single primer isothermal amplification,实时荧光SPIA)检测副溶血性弧菌的方法。实时荧光SPIA在40 min反应时间内,对3株副溶血性弧菌和16株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA检测,结果表明除3株副溶血性弧菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌纯培养DNA的灵敏度为8.2 fg/μL,对副溶血性弧菌菌悬液的检测灵敏度为13.5 CFU/m L;对鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋等4种模拟样品中副溶血性弧菌的检出限均为14.7 CFU/g。研究结果表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便。     

一株副溶血性弧菌拮抗菌的筛选、鉴定及其抑菌物质特性研究

副溶血性弧菌是一种常见的食源性病原菌和水产致病菌。该研究通过琼脂扩散法从芦潮港海泥中筛选对副溶血性弧菌具有较强抑制作用的菌株,对其进行形态观察和16S rDNA分子鉴定,并对其所产抑菌物质进行抑菌谱和理化特性研究。结果表明,筛选出的枯草芽胞杆菌H5对副溶血性弧菌ATCC 17802具有强烈的抑制作用,抑菌圈直径达（32.05±0.10）mm,其产生的抑菌物质具有广谱抑菌活性,对革兰氏阳性菌的抑制作用大于革兰氏阴性菌。通过理化性质研究发现,H5所产抑菌物质在121℃处理30 min和较宽的pH值范围内（2～12）可保持良好的稳定性,并具有良好的紫外线稳定性和有机溶剂稳定性,且Mn²⁺和Zn²⁺可提高其抑菌活性而Ca²⁺和Mg²⁺可抑制其活性。H5所产抑菌物质经过蛋白酶处理后活性下降,证明其是一种抗菌肽。综上所述,枯草芽胞杆菌H5所产抗菌肽不仅具有良好的稳定性,而且抑菌谱广、抑菌活性强,在食品工业和医药行业具有广阔的开发和应用前景。     

水产品中副溶血性弧菌实时荧光PCR检测方法

建立了一种特异、灵敏、稳定的副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)致病基因的检测方法。对已建立的副溶血性弧菌致病基因tdh、trh和tlh荧光PCR方法的特异性、灵敏度和重复性进行检测,以验证该方法的有效性。该方法与副溶血性弧菌反应良好,与其他弧菌属和非弧菌属的6株常见食源性致病菌无交叉反应;检测了6株副溶血性弧菌标准菌株和分离株,3种致病基因检出限分别为tlh 6～43 CFU/mL,tdh 97～1 700 CFU/mL,trh 1 100～4 000 CFU/mL;3种致病基因20次重复组内变异系数在0.96%～1.50%,组间变异系数在2.70%～4.10%。该方法操作简便,特异性强,灵敏度高,能够准确、快速、灵敏地检测水产品中副溶血性弧菌。     

柠檬草精油对副溶血性弧菌的抑菌活性及机制

目的:探究柠檬草精油(LG-EO)对副溶血性弧菌的抑菌活性和机理。方法:通过测定LG-EO对副溶血性弧菌的最低抑制浓度(MIC)、时间-杀灭分析、上清液中AKP活性、电导率和蛋白质泄漏量、细胞形态、膜电位、呼吸链脱氢酶活力及胞内DNA的含量和结构等,研究LG-EO对副溶血性弧菌的抑菌活性和机制。结果:LG-EO对副溶血性弧菌的MIC范围80~120 μg/mL,在80~280 μg/mL处理浓度范围,其杀灭效果随浓度和时间的增加而提高,240 μg/mL LG-EO处理10 min即可灭活全部副溶血弧菌。与高于MIC的LG-EO共培养,副溶血弧菌细胞壁、膜的完整性被破坏,导致上清液中AKP活性、蛋白质含量和电导率上升,细胞边界模糊和内容物流失。菌体细胞膜电位、呼吸链脱氢酶和ATP酶活性等显著降低。基因组DNA的核酸电泳和紫外吸收光谱提示,DNA在LG-EO作用下流失严重并与主要成分柠檬醛发生互作。结论:柠檬草精油对副溶血性弧菌有较强的抑菌作用,LG-EO通过破坏细胞壁、膜构造,干扰细胞能量代谢,造成DNA流失或变性等快速杀灭副溶血性弧菌。本研究为探明LG-EO的抑制致病性弧菌机理奠定良好的基础,在水产品加工业中具有广泛的应用潜力。     

副溶血性弧菌噬菌体的分离及其在即食虾中的应用

为了研究噬菌体作为天然生物防控剂应用于食品中的前景,本实验从水产品市场的污水中采用双层平板法分离纯化出一株烈性副溶血性弧菌噬菌体SHOU24,测定其生理特性,并探讨其在即食虾中的抑菌效果。结果表明:该噬菌体只对含有毒力基因tdh的副溶血性弧菌有裂解能力。电镜观察其形态表明该噬菌体属于长尾噬菌体科。SHOU24的最适p H为7~8。在50℃温度以下,存活率很高。抑菌实验结果表明该噬菌体在常温条件下对即食虾中副溶血性弧菌的生长具有良好的抑制作用,能使副溶血性弧菌的菌浓度下降1log CFU/g。本研究为副溶血性弧菌噬菌体SHOU24作为抑菌剂应用于食品中提供了一定的理论基础。     

柠檬醛对副溶血性弧菌的抑制作用

有效预防和控制副溶血性弧菌对食品的污染对于保障公众健康具有重要意义。本研究首先利用琼脂稀释法测定7?种植物源活性物质（丁香酸、阿魏酸、绿原酸、硫辛酸、原儿茶酸、原儿茶醛和柠檬醛）对副溶血性弧菌的最小抑菌浓度,在此基础上选择柠檬醛进行后续实验;通过检测经柠檬醛处理后的副溶血性弧菌生长曲线、细胞膜电位、胞内ATP浓度、细胞膜完整性以及细胞形态的变化,探究柠檬醛对副溶血性弧菌的抑制作用及可能的作用机理。结果表明：柠檬醛相比于其他6?种植物源活性物质对副溶血性弧菌有更好的抑菌效果,其对两株标准菌株和8?株分离菌株的最小抑菌浓度在0.10～0.60?mg/mL范围内;柠檬醛能够引起副溶血性弧菌细胞膜电位去极化、胞内ATP浓度降低及细胞膜完整性下降,同时可使细胞皱缩变形。本研究结果表明柠檬醛具有良好的抑菌功效,并有潜力作为天然的抗菌物质应用于食品工业。     

副干酪乳杆菌发酵液中抗菌肽的筛选及对副溶血性弧菌的抑菌作用

副溶血性弧菌是一种常见的食源性致病菌,严重威胁食品安全和人体健康。本研究利用超高效液相色谱-质谱联用技术鉴定副干酪乳杆菌发酵液中的多肽序列,并通过生物信息学筛选出可能的抗菌序列（RQQAENLAKFAKKG）,命名为Yt9z。研究结果表明其对副溶血性弧菌的最低杀菌质量浓度（MBC）为125μg/mL,可在3 h内将细菌完全杀死。通过膜通透、透射电镜、DNA凝胶阻滞分析、圆二色谱等试验探究其抑菌机制,结果在不同溶液环境下,抗菌肽Yt9z能改变自身的二级结构,进而增加细菌细胞膜通透性,并穿透细胞膜与DNA结合使其死亡。这些发现为抗菌肽Yt9z应用于副溶血性弧菌污染提供了理论参考。     

水产品中副溶血性弧菌LAMP检测方法的优化

本文用副溶血性弧菌不耐热溶血素（tlh）基因作靶标,优化环介导等温扩增技术检测水产品副溶血性弧菌的方法。体系用Bst DNA聚合酶催化,恒温反应60 min,产物分别用2%琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I染色鉴定,对各项反应参数进行优化;将新鲜菌液作10倍梯度稀释后进行LAMP和PCR反应,比较二者的敏感度;对32株食源性病原菌（包括分离于水产品的25株副溶血弧菌,1株副溶血性弧菌ATCC17802标准株,大肠杆菌D5、金黄色葡萄球菌CMCC26003、志贺氏菌B4、蜡样芽胞杆菌63302、单核细胞增生李斯特菌54001和沙门氏菌50041各1株）进行LAMP扩增,验证其特异性;虾样品用菌液进行模拟污染,分析LAMP的可靠性。各参数最佳条件为：Mg2+浓度为3.6 mmol/L,dNTPs浓度为0.96 mmol/L,Bst DNA聚合酶用量为4.8 U,内外引物浓度比为8:1,最佳反应温度为63 ℃,时间为60 min;LAMP的检测限为1 CFU/mL,低于PCR方法的最低检测限;特异性试验检测26株副溶血性弧菌均为阳性,6株非副溶血性弧菌为阴性;人工污染试验中检测限达1 CFU/mL,无假阳性。建立的LAMP方法操作简单且灵敏度高,适用于水产食品中副溶血弧菌的现场快速检测。     

戊糖片球菌的抑菌与共凝聚能力及其对水体中副溶血性弧菌的净化效应

研究了7株戊糖片球菌对副溶血性弧菌的抑菌特性和共凝聚能力,探讨了不同抑菌和凝聚特性的戊糖片球菌的细胞形态特征及其对水体中副溶血性弧菌的影响。结果表明7株戊糖片球菌对副溶血性弧菌的抑制作用是同p H值乳酸的1.1~1.3倍,抑菌活性对过氧化氢酶、蛋白酶以及加热处理不敏感。戊糖片球菌对副溶血性弧菌的2 h共凝聚率在14.8~37.6%之间,具有显著菌株差异性,其中菌株F28-8达到37.6%,显著高于其它菌株(P0.01)。扫描电镜结果显示菌株F28-8具有独特的细胞表面结构和粘连模式。戊糖片球菌对水体中副溶血性弧菌具有促凝聚和减菌作用,副溶血性弧菌悬液经过F28-8处理60 h,上层悬液中的可培养细胞浓度比未经处理的对照组降低了3.1 Log10 CFU/m L,显著高于低凝聚性菌株H13(P0.01),而凝聚物中可培养细胞比对照组降低了1.6 Log10CFU/m L,与H13处理无显著差异(P0.05)。     

响应面试验优化双酶酶解法制备鱼鳞抗菌肽工艺及其抑菌性能分析

采用双酶酶解法制备鱼鳞抗菌肽,进行酶筛选并通过响应面法优化酶解条件;通过葡聚糖凝胶G-25分离纯化酶解液,研究有效抑菌组分对不同菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）。结果表明,当采用碱性蛋白酶结合酸性蛋白酶分步酶解鱼鳞,底物质量浓度为30?g/100?mL时,最适酶解条件为碱性蛋白酶在pH?9.5时首次酶解,酶解时间62?min,酶解温度55?℃;酸性蛋白酶在pH?3.0时再次酶解,酶解时间3?h,酶解温度34.4?℃。此条件下制备的酶解液对副溶血性弧菌的抑菌圈直径为27.72?mm,与预测值基本相符。酶解液经层析后,其抑菌性G2组分对假单胞菌和希瓦氏菌的MIC为1.56?μg/mL,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、沙门菌及副溶血性弧菌的MIC为6.25?μg/mL。可见,双酶酶解法制备的鱼鳞抗菌肽具有较强的抑菌性。     

副溶血性弧菌毒素编码基因的微量、可视化检测

针对副溶血性弧菌主要毒素编码基因(tdh和trh),基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以毛细管为反应介质,建立一种微量(5μL)、特异、灵敏、低成本、可视化、快速检测的毛细管LAMP(capillary LAMP,cLAMP)。本研究针对每个靶标基因分别设计6条特异性引物,系统优化Mg2+、dNTPs浓度和Bst DNA聚合酶使用量,以及反应时间及反应温度等参数,确立最适cLAMP反应体系;测定该方法的灵敏度和特异性。结果表明:优化后的5μL cLAMP反应体系为6 mmol/L或8 mmol/L Mg2+,1.44 mmol/L或1.28 mmol/L dNTPs、0.096 U/μL Bst DNA聚合酶、反应温度65℃、反应时间60 min。针对靶基因tdh和trh,c LAMP方法检测副溶血性弧菌基因组DNA的最低检测限分别为3 fg/μL和34 fg/μL,纯培养物的最低检测限分别为9.85×103 CFU/mL和8.25×105 CFU/mL;且与其他6种常见致病菌(霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)均无交叉反应。本研究建立的微量、可视化cLAMP方法为食源性致病菌副溶血性弧菌检测试剂盒的研发提供了技术支撑。     

虾酱酶法模拟加工过程中的细菌学分析

对虾酱酶法加工过程中各工序的细菌总数、大肠菌群数、副溶血性弧菌和沙门氏菌进行检验。结果表明：鲜虾原料的细菌总数为3.4×104CFU/g,冰水清洗后明显降低为3.0×103CFU/g,50℃酶解3h后的细菌总数显著增加至3.7×104CFU/g,加入食盐能抑制细菌的生长;采用100℃杀菌30min,能有效杀死虾酱中的细菌,成品虾酱的细菌总数为2.6×104CFU/g。鲜虾原料的大肠菌群数为15MPN/g,冰水清洗后明显降低至3.6MPN/g,酶解作用对大肠菌群的生长影响不大,加盐、保温、杀菌能明显消除大肠菌群的污染,成品虾酱的大肠菌群数小于3.0MPN/g。虾酱加工过程中均未检出副溶血性弧菌和沙门氏菌。由此可见,冰水清洗、加盐、杀菌等工艺条件是虾酱酶法加工过程中控制细菌总数和大肠菌群数的关键工序。