原核表达抗克伦特罗重组单链抗体及其纯化研究

目的:原核表达抗克伦特罗重组单链抗体,对表达的包涵体蛋白进行提取和纯化,并鏊定重组抗体特性.方法:通过温度诱导大肠杆菌表达抗克伦特罗单链抗体,超声破碎菌体细胞,采用不同洗涤溶液提取包涵体.以不同变性剂溶解包涵体,Ni-NTA亲和柱纯化后,经脉冲稀释法将其复性.超滤及透析浓缩蛋白复性液,经Ni-NTA亲和柱二次纯化,得到纯化重组目的蛋白.通过SDS-PAGE电泳分析重组目的蛋白纯度,采用Western bloning和间接竞争EUSA对所制备的抗克伦特罗重组单链抗体特异性进行鉴定.结果:以大肠杆菌Es-cherichia coli BL21(DE3)为宿主菌诱导表达重组单链抗体,产率最高,占菌体蛋白的31%.以1 mol/L尿素洗涤包涵体,6 mol/L盐酸胍为变性剂,经Ni-NTA亲和柱纯化,所得复性重组单链抗体蛋白的纯度达96%.Western blotting分析显示,纯化并复性后的单链抗体可与鼠抗His标签蛋白单克隆抗体发生特异性的结合反应.间接竞争ELSIA结果表明,该重组抗体IC50值为3.35 ng/mL,与沙丁胺醇等结构类似物无交叉反应.结论:原核表达制备的抗克伦特罗重组单链抗体具有较好的抗原结合活性及特异性,为进一步开展克伦特罗的免疫快速检测研究奠定基础.     

无皂乳液聚合法制备单分散大粒径聚苯乙烯微球研究

采用无皂乳液聚合法制备了聚苯乙烯微球。分析了单体浓度、引发剂浓度、离子强度、反应温度对微球粒径及粒径分布的影响,优化聚合配方和工艺,制得了大粒径(粒径达1.7um)、单分散(分散指数为0.059)的聚苯乙烯微球。考察了微球在不同试剂及温度下的溶胀性能。     

金磁微粒介导多克隆抗体纯化的最优化条件研究

将牛血清白蛋白(BSA)包被在自制的金磁微粒表面,以金磁微粒与抗体比例、反应时间、反应温度为主要影响因素,依据均匀设计表,对盐酸克伦特罗(CL)多克隆抗体进行纯化,并对纯化前后抗体的效价以及抗体对CL的检测灵敏度进行了研究。结果表明,金磁微粒与抗体的比例以及两者的反应时间是影响抗体纯化的主要因素;纯化后多克隆抗体中抗BSA抗体明显下降,而抗CL抗体基本保持不变;对比纯化前后CL的检测曲线,纯化后的最低检测限(LOD)和半抑制浓度(IC50)分别下降了6.90%和24.37%。      

金磁微粒介导多克隆抗体纯化的最优化条件研究

将牛血清白蛋白(BSA)包被在自制的金磁微粒表面,以金磁微粒与抗体比例、反应时间、反应温度为主要影响因素,依据均匀设计表,对盐酸克伦特罗(CL)多克隆抗体进行纯化,并对纯化前后抗体的效价以及抗体对CL的检测灵敏度进行了研究。结果表明,金磁微粒与抗体的比例以及两者的反应时间是影响抗体纯化的主要因素;纯化后多克隆抗体中抗BSA抗体明显下降,而抗CL抗体基本保持不变;对比纯化前后CL的检测曲线,纯化后的最低检测限(LOD)和半抑制浓度(IC50)分别下降了6.90%和24.37%。     

羧基化聚苯乙烯荧光微球的合成及其在织物防伪中的应用

为解决防伪技术中荧光织物制备方法复杂和成本高的问题,采用分散聚合法制备表面带有负电荷的羧基化聚苯乙烯微球(CPS),再以阳离子表面活性剂十八烷基三甲基溴化铵为改性剂,利用静电自组装法吸附荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC),制备羧基化聚苯乙烯荧光微球(CPS-FITC),最后将其负载于织物上制备荧光织物。结果表明：所制备的荧光微球和荧光织物在紫外灯(365 nm)下具有明亮的黄绿色荧光,且放置不同时间(1～9 d)、在不同的pH值(3～11)下,经多次摩擦和水洗后均能保持良好的荧光稳定性。该制备方法操作简便、成本低且荧光强度高,可用于不同织物的防伪检测。     

活性染料/聚苯乙烯复合胶体微球的制备及其在桑蚕丝织物上的结构生色

为提高纺织品结构生色光子晶体的色彩饱和度,通过静电吸附将黑色活性染料引入带正电聚苯乙烯(PSt)胶体微球表面,制备了一种外表面吸附染料型PSt结构基元(活性染料/PSt微球),采用数码喷印方式在桑蚕丝织物上构建结构生色光子晶体。研究了染料在PSt胶体微球表面的吸附条件和吸附模型,对活性染料/PSt微球的结构形貌及所得光子晶体的排列和结构生色效果进行表征。结果表明:PSt微球表面染料的吸附量随时间、温度和染料用量的增大而增大;该吸附模型符合Langmuir型;活性染料/PSt微球具有典型的核壳结构,微球粒径较吸附前略有增大;白色蚕丝织物表面所构建的活性染料/PSt光子晶体生色结构,微球排列规整有序,呈现鲜艳明亮的结构色。     

葡聚糖多克隆抗体制备与纯化

以DextranT40和BSA的交联物为抗原,多次免疫新西兰白兔,收集血清,并用rProteinA亲和层析柱纯化抗体,成功获得较高纯度的兔抗葡聚糖多克隆抗体。用ELISA法测定其效价,抗体效价为1∶32000以上。     

聚合物微球在皮革涂饰中的应用

介绍了聚合物微球中的中空微球、可膨胀微球和交联微球的合成方法及基本性能,同时介绍了这些微球作为有机填料在皮革涂饰中的应用。     

盐酸克伦特罗酶标抗原的制备及鉴定

选取辣根过氧化物为抗原标记酶,采用重氮化法将盐酸克伦特罗CLEN分别与牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,合成包被抗原和免疫原,并通过紫外光谱扫描(UV)、SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳法验证偶联成功。这为下一步获得针对盐酸克伦特罗类特异性单克隆抗体制备及其相应食品安全检测试剂盒开发奠定了基础。     

抗克伦特罗单链抗体可溶性表达及特性鉴定

目的:表达抗克伦特罗(CBL)可溶性单链抗体(scFv)并进行抗原结合活性鉴定。方法:利用呈现scFv的重组噬菌体感染大肠杆菌HB2151,IPTG诱导可溶性scFv表达。渗透休克法提取菌体细胞周质腔中scFv。经SDS-PAGE、Western-Blotting以及间接ELISA法分析检测可溶性scFv的表达,并采用间接竞争ELISA法鉴定scFv的抗原结合活性。结果:细菌培养上清及周质腔中均有抗CBL可溶性scFv表达,其分子量约为29kD;上清液及周质腔中scFv效价分别为1:80,1:1600,能够被CBL竞争性抑制,IC50分别为0.78、0.95ng/ml。结论:可溶性抗CBLscFv在大肠杆菌HB2151中获得成功表达,表达的scFv与CBL具有很好的结合活性,可用于进一步建立CBL相应的免疫学检测方法。     

CP4-EPSPS蛋白抗体的制备及其夹心ELISA定量检测方法的建立

为了快速高效地检测转Cp4 epsps基因抗除草剂大豆,本研究利用已制备的CP4-EPSPS蛋白免疫实验动物,获得5株CP4-EPSPS蛋白鼠单克隆抗体及3份羊抗血清,建立了CP4-EPSPS蛋白双抗夹心酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测方法,同时利用该方法对结荚期的Cp4 epsps转基因抗除草剂大豆的根、茎、叶、种子进行定量检测。结果显示,最佳检测条件为捕获抗体1D12,工作浓度1.25 μg/mL,包被酶标板,4 ℃静置过夜,检测样品20 ℃孵育45 min,检测抗体8092,工作浓度2.5 μg/mL,20 ℃孵育30 min;CP4-EPSPS蛋白在模拟大豆环境中最低检测限为3.6 ng/mL,检测范围为7.5~125 ng/mL;重复性变异系数小于15%。利用上述检测条件,在转Cp4 epsps基因抗除草剂大豆的根、茎、叶、种子中均检测到CP4-EPSPS蛋白的表达,且各组织部位表达量差异显著,其中CP4-EPSPS蛋白在叶片中表达量最高,茎、种子、根中CP4-EPSPS蛋白表达量逐渐降低。     

沙丁胺醇多克隆抗体的制备与鉴定

为了对沙丁胺醇进行酶联免疫吸附法(ELISA)测定,通过四种方法制备沙丁胺醇衍生物,分别将其与牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,制备人工完全抗原,采用紫外分光光度法测定蛋白质浓度并计算偶联比,用所制备的四种免疫原免疫新西兰白兔获得抗沙丁胺醇(SAL)抗体,每一种抗体都用四种包被抗原进行配对筛选,据此得到最佳的抗体-包被抗原的组合,对筛选出的抗体用正辛酸-硫酸铵法进行纯化,采用间接ELISA法测定多克隆抗体(pAb)的效价并进行特异性鉴定。结果表明:成功偶联了完全抗原,四种免疫原的偶联比分别为9:1、6:1、6:1、12:1,得到最佳的抗体-包被抗原的组合,筛选出的抗体效价达到1:64000,此抗体对克伦特罗和特布他林的交叉反应率分别为144%和169%,对其他类似物几乎没有交叉反应。本研究为沙丁胺醇、克伦特罗和特布他林多残留酶联免疫检测法的建立奠定了基础。     

长白山林蛙输卵管糖蛋白多抗制备及应用研究

针对长白山林蛙输卵管糖蛋白制备特异性多克隆抗体。将新鲜林蛙输卵管蛋白粗提液经Sepharose Fast Flow阴离子交换柱和Sephadex G-100凝胶层析柱获得纯化的输卵管糖蛋白组分。以纯化输卵管糖蛋白免疫新西兰大白兔,制备多抗血清,采用辛酸- 饱和硫酸铵法对多抗进行纯化并鉴定。结果表明：纯化后的多抗ELISA 效价为1:64000,纯化多抗具有较高的敏感性和特异性,效价较高。利用制备的多抗对长白山林蛙输卵管分泌细胞进行免疫组织化学定位,为分泌细胞培养产物中输卵管糖蛋白进行检测提供研究条件。     

苏丹红Ⅰ单克隆抗体的制备及其间接竞争ELISA 检测

重氮法合成苏丹红Ⅰ的结构类似物,通过活性酯法将苏丹红Ⅰ的结构类似物偶联到载体蛋白上制备人工抗原,用所制备的人工抗原免疫BALB/c 小鼠,采用细胞融合的方法制备苏丹红Ⅰ单克隆抗体,结果成功筛选到一株抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体,经鉴定为IgG2a 型,并建立间接竞争ELISA 检测方法,线性范围为0.5～10ng/mL,检测下限为0.1ng/mL,加标回收率为52.3%～110%,变异系数为3.2%～8.9%。     

盐酸克伦特罗免疫原的合成与鉴定

盐酸克伦特罗是一种只具有免疫反应性不具有免疫原性的小分子半抗原。本文采用重氮化法将其与牛血清白蛋白交联，用紫外扫描和SDS变性凝胶电泳方法检验。并用合成的CL-BSA免疫小鼠，经ELISA检验，小鼠产生了针对CL的抗体，表明合成的CL-BSA复合物具有免疫原性，为盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及其检测试剂盒的研制奠定了基础：     

芝麻过敏原油质蛋白O leosins单克隆抗体的制备与鉴定

利用细胞融合技术制备小鼠抗油质蛋白杂交瘤细胞,通过间接ELISA方法筛选稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株。获得10株杂交瘤细胞,分别命名为1B2、2D8、2F3、3A4、3D7、3F8、4A10、4F12、6A12、6E7,利用Ig亚类鉴定试剂盒鉴定各单克隆抗体的Ig亚型,除1B2、3D7、3F8为IgG1类外其余均为IgG2a类型。将杂交瘤细胞株注射入小鼠腹腔获取腹水,应用Protein A亲和层析法对腹水进行纯化。单抗效价有9株在2.0×105以上。ELISA和Western blotting分析表明这些单抗均能特异性识别芝麻过敏原油质蛋白。     

克仑特罗食物中毒的酶联免疫法筛选与气-质联机确证研究

本文采用酶联免疫法筛选和气-质确证对克仑特罗食物中毒病因学诊断技术进行研究。组织样品经匀浆初提,液液萃取;生物材料经离心适当稀释,上酶标板显色进行筛选测定。克仑特罗浓度的自然对数与吸光度比值呈线性关系,线性方程Y=-22.078ln(X)+199.24,相关系数为0.9922。检出限为0.1μg/kg。在对猪肝、鸡肉和尿液样品基质的不同加标水平的回收率在50.5%～92.0%之间,相对标准偏差在12.3%～18.1%之间。中毒者食用中毒食品(酱猪肝)及血液和尿液的测定结果与气质联机法确证结果基本吻合,而且生物体液(特别是尿液在中毒7d内仍可以作为克仑特罗食物中毒的辅助病因学诊断材料。     

动物性食品中盐酸克伦特罗(瘦肉精)残留危害及其检测方法研究进展

介绍了盐酸克伦特罗 (瘦肉精 )的理化特性 ,分析了它在动物性食品中残留对人体和国民经济所造成的危害 ,同时又综述了动物肌肉组织中残留盐酸克伦特罗 (瘦肉精 )的各种分析检测方法并作了展望     

3 种抗糖皮质激素抗体的制备、纯化与鉴定

采用活性酯法合成地塞米松(DEX)、倍他米松(BET)、双氟米松(FLM)3 种免疫原和包被原,用免疫原分别免疫2 只新西兰大白兔,5 次免疫后进行采血获得抗血清。用盐析与DEAE- 纤维素离子交换联用的方法纯化抗血清,再用间接酶联免疫法测定抗血清的效价,其中较好的抗血清效价分别高达345600、614400、307200,具有较好的亲和性,可以满足抗原抗体反应的动力学要求。