豆科植物不同发育阶段不同部位乙酰胆碱酯酶活性研究

采用比色法研究不同种类豆科植物于不同发育阶段、不同部位乙酰胆碱酯酶(AChE)活性,并测定其总酯酶活性、蛋白质含量、水分含量,旨在为农药残留快速检测提供配套的新酶原。结果表明,在不同种类的豆科植物中均检测到乙酰胆碱酯酶活性,但不同种类豆科植物存在差异,干种子期、幼芽期及幼苗期各部位的乙酰胆碱酯酶活性存在差异,以每克干物质中乙酰胆碱酯酶酶活计,干种子期猪腰豆(Whitfordiodendron filipes Dunn)中乙酰胆碱酯酶酶活性最高,为10.28U/g干重。     

小麦酯酶提取及其对有机磷农药检测初探

研究从小麦面粉提取小麦酯酶提取条件及其粗酶液对4种有机磷农药最低检测限和灵敏度。运用单因素实验和正交实验对小麦酯酶提取条件进行优化,确定适宜提取条件,提取液为0.15 mol/L NaCl溶液、料液比1∶4、40℃振荡提取60 min,提取粗酶液酶活为1.675 U/mL;并确定粗酶液对敌敌畏、敌百虫、乐果和毒死蜱等4种有机磷农药最低检测限分别为0.05 mg/kg、0.04 mg/kg、0.05 mg/kg和0.07 mg/kg,均低于国家规定农药最大残留量,且粗酶液对敌敌畏灵敏度最佳。     

小麦酯酶的纯化、冻干及对有机磷农药的检测

该文研究从小麦面粉提取的小麦酯酶粗酶液的纯化、冻干和其有机磷农药的最低检测限。确定了用饱和度为30%和60%的硫酸铵对小麦酯酶粗酶液进行分段盐析,纯化后酶液的比酶活是纯化前的2.4倍;最佳保护剂为5%的聚乙二醇,它不仅可以有效保护纯化后的小麦酯酶在冷冻干燥过程中不失活,而且还具有良好的稳定性;最后确定了冻干小麦酯酶酶粉中敌敌畏、敌百虫、毒死蜱、乐果和辛硫磷等5种有机磷农药最低检测限分别为0.01 mg/kg、0.02 mg/kg、0.05 mg/kg、0.07 mg/kg和0.03 mg/kg,均低于国家规定农药最大残留量,冻干酶粉对敌敌畏灵敏度最佳。     

农药检测用植物酯酶的筛选及提取工艺优化

从10种植物种子中提取植物酯酶,以总酯酶活力、比活力以及对有机磷农药的灵敏性为指标,筛选出最佳植物酯酶,并研究其最优提取工艺。结果表明:大白豆的总酯酶活力和比活力均高于其它9种,对有机磷农药的敏感性也较强;大白豆酯酶的最佳提取工艺为以0.04mol/L pH 7.0的磷酸缓冲液为提取液,料液比1∶6(m∶V),搅拌提取90min。     

有机磷农残检测用植物酯酶的研究

本文研究了多种植物种子中植物酯酶的提取方法和总酯酶活力,得出了最佳提取条件。并且研究了不同来源的植物酯酶对有机磷农药的敏感性,确定了黄豆来源酯酶对敌敌畏等五种农药的最低检测限。结果表明,以黄豆来源的植物酯酶的总酯酶活力和敏感性为最好。     

家蝇乙酰胆碱酯酶基因密码子优化及酶学特性表征

基于密码子通用性及不同物种密码子使用频率差异原则,对家蝇乙酰胆碱酯酶的基因序列进行优化,旨在提高其在毕赤酵母中的表达量,增强其应用前景。将基因序列中的低频密码子更换为毕赤酵母偏好的密码子,同时调整乙酰胆碱酯酶各区段GC含量至45%~55%。将优化的家蝇乙酰胆碱酯酶连接至表达载体pPIC9K并转入毕赤酵母GS115中,摇瓶培养。以改进的Ellman法测定重组家蝇乙酰胆碱酯酶（mdAchE）酶学性质,通过有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组酶mdAchE的生物活性。家蝇乙酰胆碱酯酶密码子优化后在毕赤酵母中实现高效表达,酶活力约8.82 U/mL。抑制试验显示,重组酶mdAchE能够被马拉硫磷等7种有机磷农药,克百威等8种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC15值为1.83×10-15 μg/mL,远远低于其它诸如气相色谱法、生物传感器等方法测得的最低检测限（0.01 μg/mL,4.14×10-6 μg/mL）。本试验结果表明,重组乙酰胆碱酯酶mdAchE在有机磷及氨基甲酸酯类农药残留的检测领域具有较大的应用潜力。     

酶抑制法检测蔬菜中有机磷农药残留

对酶抑制法快速检测有机磷农药残留进行研究.以鲫鱼脑、肝脏和肌肉乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)为检测用酶,对5种蔬菜中有机磷农药残留进行检测.根据AChE酶活抑制率和农药抑制方程,判断农药残留情况.当AChE酶活抑制率大于35%时,可判断该样品中农药残留超标.结果表明,试验中5种蔬菜样品农药残留均未超标.除豆角外,该方法的回收率均在80%～120%之间,表明该方法的检测结果准确可靠.     

黑豆酯酶检测氧乐果残留条件的优化

目的研究以氧乐果为代表的有机磷农药残留检测条件。方法以黑豆酯酶为酶源,a-乙酸萘酯为底物,采用酶抑制法,考察黑豆酯酶稀释倍数、显色时间、反应温度3个因素对黑豆酯酶活力测定的影响。然后通过3因素3水平响应面法优化黑豆酯酶活力的测定条件,并确定氧乐果对黑豆酯酶的最佳抑制时间和检测的灵敏度。结果当黑豆酯酶稀释倍数为18,显色反应时间为10 min,反应温度为41℃时,黑豆酯酶活力测定的吸光度值达到0.811。氧乐果抑制黑豆酯酶的最佳时间是4 min。绘制氧乐果对黑豆酯酶的标准曲线,得到最低检测限为0.1μg/mL。结论本研究获得了以黑豆酯酶抑制法检测氧乐果残留的最佳条件,其检测限低于有机磷农药氧乐果残留检测的最低限值要求(0.2μg/mL)。因此,以黑豆酯酶为酶源的酶抑制法可以作为有机磷农药氧乐果残留快速检测的一种有效手段。     

植物酯酶法检测有机磷农药的敏感性和检测限的研究

采用本室自制的植物酯酶,对19种有机磷农药进行了敏感性试验,并测定了该酶对这19种有机磷农药的最低检测限(LOD)。研究表明,所制备植物酯酶对受试的18种有机磷农药均有良好的敏感性,且最低检测限远低于国家规定的最大残留限量(MRL),因此,该酶可作为有机磷农药残留检测用酶。     

农药生物传感器所用酶的比较研究

在利用农药对酶的抑制反应来检测农药的方法中，选用的酶既可以是动物酯酶，也可以是植物酯酶。本文采用分光光度计法，对植物再生产 动物酯酶在不同pH值下的酶活，抑制程度等性质进行了实验研究。结果表明：动物酯酶中的苍蝇酶，蝇蛆酶与植物酯酶中的小麦酯酶相比，它们的活力和被农药抑制程度处于相近的;植物酯酶中小麦与玉米相比，玉米酯酶的活力远低于小麦酯酶的活力，不适于用来进行抑制反应检测农药。动物酯酶在pH值为7．5时活力最高，小麦酯酶在pH值6．5时最高。     

鸡肝酯酶在有机磷和氨基甲酸酯类农药检测中的应用研究

利用农药对酯酶活力的抑制反应,分别采用游离的和固定化的鸡肝酯酶,对不同浓度的敌敌畏、敌百虫、马拉硫磷和西维因进行了测定。结果发现,在低浓度时,农药浓度的对数值与其对应的酶活抑制率之间具有较好的线性关系;并且与游离鸡肝酯酶相比,固定化酶不同程度地降低了对农药检测的下限值。敌敌畏、马拉硫磷和西维因的检测下限值依次从游离酶检测时的0．001、4．34和2．52mg/L,降低到了用固定化酶检测时的0．00004、0．0004和0．78mg/L。固定化的鸡肝酯酶对敌百虫的检测下限改善不大。     

基于MnO2纳米片类氧化酶特性的有机磷农药荧光分析方法建立

利用MnO2纳米片类氧化酶特性并结合有机磷农药的酶抑制原理,构建一种快速、简便、高灵敏有机磷农药荧光分析方法。通过测定反应体系荧光强度前后的变化,可以检测样品中有机磷农药的含量。通过优化酶浓度、底物浓度和反应时间,发现乙酰胆碱酯酶浓度为9.375 U/L,底物浓度为10 mmol/L,反应时间为11 min时,该荧光分析方法检测性能最佳,对氧磷的动态检测范围为1.56～200 ng/mL,检出限达到0.5 ng/mL（RSN=3）,运用该方法测定标准添加的自来水、卷心菜、燕麦样品的回收率在83.4%～105.9%之间,表明该方法具有很高的灵敏度与准确性,为快速高灵敏测定有机磷农药提供一种新的可能。     

凝胶渗透色谱净化结合气相色谱-三重四极杆质谱法测定植物油中多农药残留量

建立了凝胶渗透色谱法结合气相色谱-三重四极杆质谱测定植物油中多种类型农药残留的方法(有机磷农药、有机氯农药、拟除虫菊酯农药、氨基甲酸酯农药、三唑类杀菌剂、植物生长调节剂等)。样品使用乙酸乙酯-环己烷(1∶1,V/V)溶解后,经全自动凝胶渗透色谱仪净化,色谱柱流速为5 m L/min,收集时间为7~20 min,然后进行在线自动真空浓缩,正己烷溶剂将样品定容到1.0 m L,使用气相色谱-三重四极杆质谱仪的选择反应监测模式进行定性和定量分析。在相应线性范围内,所有化合物线性关系良好,线性相关系数R2在0.990 0~0.998 5之间。在0.05~0.40 mg/kg添加水平时,平均回收率为60.5%~118.0%,相对标准偏差(RSDs,n=6)为1.3%~14.5%,检出限在0.002~0.01 mg/kg之间,满足国内外对植物油中农药最大残留限量的标准要求。     

大孔树脂法纯化黑豆酯酶的工艺优化

目的对采用大孔树脂法纯化黑豆酯酶的工艺进行优化,确定其最佳工艺条件。方法首先通过静态吸附和洗脱试验,以黑豆酯酶的吸附率和洗脱率为指标,筛选最佳树脂。然后进行动态吸附和洗脱试验,研究上样稀释倍数、洗脱剂体积分数和洗脱剂体积3因素对洗脱率的影响。最后以黑豆酯酶得率和比活力为指标,用L_(16)(4~3)正交实验进行优化。结果通过筛选发现,D301R树脂吸附率和洗脱率都较高。动态吸附和洗脱实验中获得最佳工艺条件为:上样稀释倍数为40倍,洗脱剂体积分数为60%,洗脱剂用量为20 mL。在此条件下黑豆酯酶得率为(89.39±1.65)%,黑豆酯酶比活力(6.585±0.090)U/mg。结论与粗酶的纯度相比,优化后的大孔树脂法纯化黑豆酶工艺的提纯倍数达到6.143倍,为黑豆酯酶的提纯和有机磷农药残留的检测提供了科学依据。     

QuEChERS-液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中6种氨基甲酸酯农药及其代谢物的含量

目的建立QuEChERS-液相色谱串联质谱法测定蔬菜中6种氨基甲酸酯农药及其代谢物的含量。方法蔬菜中氨基甲酸酯农药及其代谢物经乙腈提取QuEChERS试剂净化,采用液相色谱-串联质谱法多反应监测模式对6种氨基甲酸酯农药及其代谢物进行定量测定。结果通过减少进样量有效抑制基质效应对定量结果的影响。该方法线性范围10～200 ng/mL,相关系数(r)为0.9937～9997。在3种基质(黄瓜、白菜、菠菜)中添加3个浓度水平(0.01、0.03、0.32mg/kg)的回收率为57.5%～110.2%,相对标准偏差为2.53%～12.0%,检出限为0.002～0.003mg/kg。结论该方法操作简便、快速、灵敏、适用于蔬菜中氨基甲酸酯农药及其代谢物的监测工作。     

QuEChERS-气相色谱串联质谱法同时测定番茄中46种农药残留

建立一种QuEChERS结合气相色谱-串联质谱同时检测番茄中46种杀菌剂和杀虫剂残留的分析方法。样品用乙腈提取,经PSA、C₁₈、无水MgSO₄净化,HP-5MS色谱柱分离,采用多反映监测（MRM）模式检测,基质匹配外标法定量。结果表明,46种农药在0.005～0.500 μg/mL的浓度范围内线性关系良好（R2>0.999）,方法检出限和定量限分别在0.07～2.63 μg/kg和0.21～8.39 μg/kg之间;在0.0025、0.025、0.25 mg/kg的加标水平下,46种农药化合物平均加标回收率在70.40%～115.08%范围内,相对标准偏差为0.22%～4.89%。50批次番茄样品中9批次检出毒死蜱和嘧菌酯残留,含量范围在0.0043～0.0365 mg/kg,均未超出GB 2763-2021标准规定的限量值。本方法快速、简单、灵敏、准确,能够满足番茄中多农药残留的检测。     

Effect of Several Germination Treatments on Phosphatases Activities and Degradation of Phytate in Faba Bean (Vicia faba L.) and Azuki Bean (Vigna angularis L.)

Abstract: Two assays were conducted to investigate the changes of faba bean (Vicia faba L.) and azuki bean (Vigna angularis L.) phosphatases (phytase [Phy] and acid phosphatase [AcPh]) and the degradation of its substrates (inositol phosphate esters) during seed germination. The 1st assay was to establish the optimal germination conditions of faba bean and azuki bean to improve the endogenous phosphatases and increase the hydrolysis of phytate and, in the second assay, to determine the different lower phosphate esters of myo‐inositol produced during the germination process. In the 1st assay, seeds were soaked for 12 and 24 h and germinated for 3 and 5 d with and without the addition of gibberellic acid (GA₃). In the second assay, seeds were soaked for 12 h and germinated for 1, 3, and 5 d with GA₃. Phy (up to 3625 and 1340 U/kg) and AcPh (up to 9456 and 2740 U/g) activities, and inositol hexaphosphate (IP6) (8.23 and 7.46 mg/g), inositol pentaphosphate (IP5) (0.55 and 0.82 mg/g), and inositol tetraphosphate (IP4) (0.26 and 0.01 mg/g) were detected in ungerminated faba bean and azuki bean, respectively. The germination process caused a significant increase of Phy and AcPh activities in faba bean (up to 147% and 210%) and azuki bean (up to 211% and 596%) and a reduction in the phytate phosphorus content (up to 81% and 63%, respectively). Phytate phosphorus content was affected only by soaking time in the case of faba bean. Finally, during the course of germination, IP6 and IP5 were rapidly degraded in faba bean (88% and 39%) and azuki bean (55% and 56%), and IP4 was only a short‐living intermediate, which was increased during hydrolysis and degraded to inositol triphosphate. In this manner we could obtain a low‐phytate, endogenous phosphatase‐rich ingredient for enhancing human nutrition.     

茶叶农药残留检测中咖啡因干扰的去除

用热水(45℃)＋有机溶剂(二氯甲烷)的提取法,结合Carbosil 小柱(用于有机磷农残)和Florisil 柱(用于菊酯类农残)净化处理,除去茶叶中的咖啡因对农药残留检测的干扰;对茶叶中常检农药残留如拟除虫菊酯类农药(联苯菊酯、甲氰菊酯、氰戊菊酯 、氯氰菊酯、溴氰菊酯等) 和有机磷农药( 滴滴畏、乐果、甲基对硫磷、喹硫磷、三唑磷等)在三个加标水平0.2、0.8、1.6mg/kg 上进行了方法的单实验室验证。结果表明：本前处理方法能有效去除茶叶中咖啡因对农药残留检测的干扰;对上述有机磷农残各加标水平上的平均回收率在73%～112.9% 之间,RSD<8%,最低检出限在0.002～0.02mg/kg;对上述菊酯类农残各加标水平上的平均回收率在78.8%～105% 之间,RSD<9%,最低检出限在0.001～0.006mg/kg,均符合或优于我国和欧盟有关法规的规定。     

气相色谱法同时测定氢化植物油中六种有机磷农药

建立了氢化植物油中有机磷农药的气相色谱测定方法。样品中的有机磷农药,用二氯甲烷-硫酸钠溶液萃取,经净化、浓缩后,用HP-1701毛细管柱、火焰光度检测器进行测定。以保留时间、峰面积进行定性、定量分析。方法检出限为0.01mg/kg,回收率为87.5%～93.3%。