基于单克隆抗体的双酚A半抗原直接包被的酶联免疫吸附法的建立

传统的人工抗原包被酶联免疫吸附法(ELISA)依赖疏水相互作用将人工抗原与酶标板结合,会影响半抗原的呈现与识别,且多采用多克隆抗体为检测抗体,这些均会导致检测灵敏度下降和标准化难度增大。该研究选择双酚酸(BVA)作为双酚A(BPA)的半抗原与蛋白质偶联制备人工抗原免疫BALB/c小鼠,获得一株可分泌BPA单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株。利用3-氨丙基三乙氧基硅烷硅化处理酶标板,将BVA直接包被在酶标板上,建立了一种基于MAb的半抗原直接包被的BPA间接竞争ELISA法。该检测方法最低检测限IC10为0.29 ng/mL,半数抑制率IC50为5.4 ng/mL,水样中加标回收率为94.04%~102.31%。与人工抗原包被BPA ELISA检测方法(IC10:0.5 ng/mL,IC50:16.65 ng/mL,水样中加标回收率为89.72%~105.25%)相比,检测灵敏度显著性提高。     

直接竞争酶联免疫吸附法用于糖浆类保健食品中西地那非检测的研究

建立了一种在保健食品中检测西地那非的直接竞争酶联免疫吸附分析法(dc ELISA)。经优化最佳反应条件为:包被浓度为100ng/m L,酶标抗体稀释倍数为70倍,标准品稀释液为p H=9,0.01mol/L PBST溶液,抗体竞争反应50min。本方法的半抑制浓度IC50为1.47ng/m L,线性范围(IC20~IC80)为0.12~17.65ng/m L,检测限IC15为0.0845ng/m L,批内批间变异系数均小于20%,保健食品补肾糖浆的添加回收率在86.0%~111.0%之间,满足实际样品的快速筛检需求。     

呋喃西林代谢物多克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法

为了建立检测呋喃西林代谢物(SEM)的酶联免疫吸附分析方法(ELISA),将所设计合成的系列半抗原与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原并免疫新西兰大白兔,筛选获得源于新颖半抗原H3的具有高亲和力、高特异性抗SEM多克隆抗体。同时,基于设计合成的系列同/异源包被抗原,考察了不同结构包被原对ELISA灵敏度的影响,发现H4-OVA作为异源包被原建立SEM的ELISA检测方法可获得最佳的检测效果,结果显示:ELISA方法的半抑制浓度(IC50)为12.37ng/mL;定量检测线性范围(IC20～IC80)为0.439～110.78ng/mL;检测限(IC10)达0.07ng/mL,达到了国内外相关检测限量要求,可应用于实际食品样品检测。     

氯霉素ELISA检测试剂盒的研制及其性能测试

采用包被多克隆抗体直接竞争ELISA法建立了氯霉素残留的酶联免疫分析方法,并构建了氯霉素残留ELISA检测试剂盒.研究结果表明,所选用的抗体对氯霉素亲合力强、特异性高,试剂盒对氯霉素残留检测的线性范围为0.24～250 ng/mL,检测限(IC10)0.47 ng/mL,样品的加标回收率70%～130%.试剂盒性能测试结果表明,其准确性和重现性较好,保存期至少6个月,可用于虾肉、鸡肉、蜂蜜、鲜奶样品中氯霉素残留的批量快速、廉价检测.     

半抗原直接包被的四环素酶联免疫吸附分析法的建立

为建立更优的四环素（tetracycline,TC）酶联免疫吸附分析法（enzyme?linked immunosorbent assay,ELISA）,将TC 与蛋白质偶联制备人工完全抗原免疫BALB/c 小鼠,获得抗TC 的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）。采用酸性高锰酸钾羧化酶标板,将TC 直接包被在酶标板上,并对ELISA 反应体系条件进行优化,构建一种半抗原直接包被的TC ELISA 检测方法。所制备的MAb 特异性良好,交叉反应率低。所构建的检测方法最低检测限IC10 值为0.306 ng/mL,半数抑制率IC50值为9.26 ng/mL,牛奶和水中加标回收率分别为96.46%～101.89%、96.84%～102.50%。与人工完全抗原包被的检测方法相比（IC10值：0.624 ng/mL,IC50值：28.24 ng/mL,牛奶和水中加标回收率分别为93.86%～105.12%、94.04%～105.56%）,检测灵敏度有明显提高,并可用于实际样品中TC 含量的检测,具备良好的应用前景。     

草甘膦单克隆抗体的制备及酶联免疫分析方法的建立

目的 制备出草甘膦(glyphosate,GLY)单克隆抗体,建立间接竞争酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)快速检测茶叶中GLY的方法。方法 首先合成GLY完全抗原(包被原和免疫原),通过免疫小鼠成功制备出GLY单克隆抗体。根据ELISA的检测流程,采用棋盘法确定最佳包被抗原和抗体的稀释倍数,确定最佳包被的温度和时间,并确定最佳加入一抗、二抗后反应时间,建立检测方法并对其性能进行评价。结果 GLY包被抗原和抗体的稀释倍数为1:2000,包被温度为37℃、包被时间为90 min,加入一抗、二抗后反应时间为60min。该方法的线性方程为Y=-0.2353X+0.6539(r²=0.9871),半抑制浓度(50%inhibiting concentration, IC₅₀)为4.508 ng/mL,检出限为1.18 ng/mL。变异系数均在10%以下,与异菌脲、多菌灵、三唑磷、甲基对硫磷、噻菌灵这5种标准品的交叉反应率均低于0.03%,在茶叶中加标回收率为90.86%～110.35%,...     

恩诺沙星快速酶联免疫吸附法检测试剂盒的研制

目的：研制恩诺沙星酶联免疫吸附法检测试剂盒。方法：采用EDC-NHS 法制备ENR-M-BSA 免疫原和ENR-OVA 检测抗原,用ENR-M-BSA 免疫BALB/C 小鼠,采用甲基纤维素半固体培养基法筛选单克隆抗体并采用间接竞争ELISA 对其进行分析。结果：通过公式计算ENR-M-BSA 摩尔偶联比为15:1,ENR-OVA 摩尔偶联比为7.2:1。筛选出1 株特异性分泌株3E9,其腹水纯化后间接竞争ELISA 测其效价为107,分型试剂盒测试显示此抗体属于IgG1 型;检测限为1ng/mL,线性范围在1～100ng/mL 之间,半量抑制浓度(IC50 值)为10ng/mL,与4 种结构类似物交叉反应均小于1%。结论：此株单克隆抗体可以用来建立恩诺沙星ELISA 检测试剂盒。     

竞争抑制酶联免疫吸附法快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素P

目的 建立一种稳定性强、灵敏度高的快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素P(staphylococcal enterotoxin P,SEP)的单克隆抗体竞争抑制酶联免疫吸附法(Enzyme-linked Immunosorbent assay,ELISA)。方法 根据ELISA的检测程序,利用交叉方阵滴定法确定SEP抗原的最佳包被浓度及单克隆抗体的最佳倍比稀释浓度,再对辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(HRP-IgG)最佳稀释浓度及最佳反应时间进行筛选,然后通过测定450nm处不同SEP抗原包被条件(包被液类型、包被环境)、封闭液类型及浓度、封闭时间、竞争反应温度、反应方式(预混反应、直接反应)下的OD值对检测条件进行优化,最后用灵敏度、批内变异、批间变异和加标样品回收率对方法进行评价。结果 SEP抗原最佳包被浓度为2.5 μg/mL,鼠单抗血清稀释度1:6000,酶标抗稀释度1:3000;反应1 h,最佳包被条件为磷酸盐缓冲液4 ℃过夜,10%脱脂乳封闭2 h,37 ℃直接竞争反应。此方法的线性回归方程为：y = 0.4166x - 0.7415(R2 = 0.9908),灵敏度为0.954 μg/mL,批内及批间变异系数均低于3 %,对人工污染的脱脂牛奶、LB液体培养基中肠毒素蛋白SEP的回收率高于98%。结论 本实验建立了一种能够快速检测葡萄球菌肠毒素SEP的ELISA方法。     

玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA方法的建立

本研究以玉米面为例,建立了玉米赤霉烯酮间接竞争ELISA (ic-ELISA)方法.采用棋盘滴定法确定抗原和单抗的最佳工作浓度,并确定了抗原37℃包被1h、不封闭、酶催化底物作用时间15 min的反应条件进行检测.该方法的检测范围(IC20～IC80)为11 ～292 pg/mL,检测限(IC10)为6 pg/mL.玉...     

氟喹诺酮药物格林沙星抗体制备及其icELISA方法建立

目的:制备格林沙星多克隆抗体并建立间接竞争酶联免疫吸附分析方法(icELISA)。方法:采用碳二亚胺法将格林沙星偶联于牛血清白蛋白(BSA)作为免疫原,免疫新西兰大白兔获多克隆抗体;采用活泼脂法分别将格林沙星、克林沙星、加替沙星、培氟沙星和沙拉沙星偶联于卵清白蛋白(OVA),制备5种包被抗原并做性能比较;建立icELISA方法并对其灵敏度和特异性进行评价。结果:成功制备了免疫原和包被抗原及抗体,抗体效价最高达64 000倍。以克林沙星-OVA作异源包被,建立的icELISA方法灵敏度最高,半抑制药物浓度(IC50)为9.14 ng/mL,检测限(IC10)为0.9 ng/mL,检测范围(IC20~IC80)为2.3~36.4 ng/mL,与其他喹诺酮类药物无明显交叉反应。结论:首次制备出格林沙星抗体并建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法,该法灵敏度高、特异性强,为分析生物样品中格林沙星含量的测定提供了1种新的方法。     

化学发光酶联免疫法检测苏丹红Ⅰ

为检测食品中苏丹红Ⅰ残留,建立间接竞争化学发光酶联免疫分析（chemi luminescent enzymeimmunoassay,CLEIA）法。通过优化包被抗原中本抗原与载体物质的量比、包被抗原质量浓度、抗体稀释比例,建立竞争抑制曲线。线性范围为0.156～5 ng/mL,最低检测限为0.078 9 ng/mL,IC50为0.679 ng/mL。CLEIA回收率为75.08%～112.18%,变异系数为8.89%～15.61%;通过与酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法进行比较,在相同抗原抗体质量浓度条件下,CLEIA法测定的IC50较ELISA方法降低30%,具有较高的灵敏度。     

雌二醇间接竞争酶联免疫吸附方法的建立

建立食品中雌二醇免疫分析方法。将雌二醇进行结构改造合成半抗原并经过核磁氢谱和红外光谱验证,再采用活泼酯法与载体BSA和OVA偶联制备人工抗原,免疫兔子制备多克隆抗体,经过反应条件优化建立间接竞争酶联免疫吸附检测方法。结果表明：IC50为3.9ng/mL,检测限为0.3ng/mL,交叉反应率均小于1.21%。检测方法具有高灵敏度和特异性,可应用于食品中雌二醇检测试剂盒的研制。     

酶联免疫吸附法检测动物源性食品中恩诺沙星残留量

为检测动物源性食品中恩诺沙星残留量,评估基于卵黄抗体的间接竞争酶联免疫吸附法检测恩诺沙星的可行性,用活性脂法将恩诺沙星同卵清蛋白偶联制备免疫原和包被抗原并用紫外光谱进行验证。用聚乙二醇-6000提取卵黄抗体。五免之后效价达到峰值1∶32 000。用间接竞争酶联免疫吸附法确定包被原质量浓度、卵黄抗体的稀释倍数和IC_(50)分别为38 ng/m L、1∶64 000和18.207 ng/m L,回归曲线方程为y=0.891 1-0.016 5x(R~2=0.990)。结果表明,制备的抗恩诺沙星卵黄抗体为进一步建立检测动物源性食品中恩诺沙星的残留的免疫方法提供参考依据。     

基于单链抗体的呋喃唑酮酶联免疫检测方法的建立

目的:为快速检测呋喃唑酮(furazolidone,FZD)在动物性食品中的残留量。方法:基于单链抗体的间接竞争酶联免疫吸附实验法建立了FZD检测方法。结果:最佳抗原工作质量浓度为2μg/m L,最佳抗体稀释倍数为1∶500,一抗最佳反应时间为60 min,二抗最佳反应时间为45 min,四甲基联苯胺最佳显色时间为20 min。FZD检测试剂盒在10~100 ng/m L范围具有较好的线性关系,IC50值为13.01 ng/m L,检出限为1.28 ng/m L,回收率为73.38%~84.52%。结论:与抗FZD单克隆抗体相比,所建立的检测试剂盒检测范围更广,且具有很高的灵敏度以及很好的特异性和稳定性。     

异丙威单克隆抗体的制备及鉴定

异丙威是我国农业生产中常见的杀虫剂,在果蔬、粮食和烟草等中都有广泛应用,然而这类农药也具有较强生物毒性。为了制备异丙威单克隆抗体,以实现对农药异丙威药物的快速检测。本文以2-异丙基苯酚等为原料,合成异丙威半抗原及人工抗原,并通过免疫小鼠、细胞融合、克隆、筛选获得单克隆抗体细胞株,经腹水诱导法及辛酸-硫酸铵沉淀法制得异丙威单克隆抗体,通过间接竞争ELISA法对抗体的特异性进行鉴定。结果表明,制备的异丙威单克隆抗体检测范围为1.88~82.80 ng/m L,抗体的IC50为11.70ng/m L,最低检测限为0.54 ng/m L,抗体与克百威、西维因、涕灭威、灭多威、2-异丙基苯酚5种异丙威结构类似物均无明显交叉反应,具有高特异性,能够满足农产品中异丙威残留检测的要求。异丙威单克隆抗体的制备为异丙威快速检测产品的开发奠定了基础。     

环丙沙星衍生物的制备及其抗体特异性研究

本文研究了环丙沙星(CPLX)羧基衍生物及其抗体的制备,并对该衍生物抗体的特异性进行了测定。将环丙沙星与3-溴丙酸反应,生成环丙沙星的羧基衍生物(CPLX-COOH),通过制备液相进行纯化,用红外光谱(IR)、电喷雾电离质谱(ESI-MS)与核磁共振法(NMR)进行鉴定;将环丙沙星衍生物分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)进行偶联,分别制备免疫抗原(CPLX-COOH-BSA)和包被抗原(CPLX-COOH-OVA),并用紫外光谱法进行鉴定。用免疫抗原免疫BALB/c小鼠,制备环丙沙星衍生物多克隆抗体。通过ELISA方阵滴定法,确定包被抗原的最佳包被浓度和抗体最佳稀释度,建立了CPLX-COOH间接竞争ELISA检测方法,其半抑制浓度IC50为228.56 ng/mL,最低检出限(LOD)为25.527 ng/mL,该抗体具有广谱特异性,可与多种氟喹诺酮类药物发生交叉反应,可进行氟喹诺酮类药物残留的多元检测。     

氟乐灵抗体的制备及其酶联免疫分析方法的建立

该研究针对农(水)产品中氟乐灵农药残留的问题,建立了间接竞争酶联免疫分析方法,快速检测氟乐灵农药.利用3,5-二硝基-4-氯-三氟甲苯与仲胺侧链氨基反应合成半抗原2C,采用碳二亚胺法将半抗原2C与牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联合成完全抗原.通过免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体PcAb-2C,基于间接竞争酶联免疫分析方法原理对...     

抗杀螟硫磷生物素化纳米抗体的制备及其在免疫检测方法中的应用

本研究制备了一种抗杀螟硫磷生物素化纳米抗体并将其应用于免疫分析方法检测食品中杀螟硫磷残留。将杀螟硫磷人工抗原免疫羊驼,四次免疫后从外周血单核细胞获取羊驼的重链抗体可变区(VHH)基因,构建了纳米抗体基因文库,库容量为10~7 cfu。通过噬菌体表面展示技术进行四轮淘筛,得到9株不同序列的纳米抗体,优选了灵敏度最高的Nbsm6克隆。将Nbsm6基因克隆到p INQ载体中进行定向生物素化并可溶性表达与纯化,用于构建间接竞争酶联免疫分析方法。在最优工作条件下,该方法检测杀螟硫磷半抑制浓度(IC_(50))为2.0 ng/m L,线性范围(IC_(20)～IC_(80))为0.6～6.9 ng/m L,检测限(IC_(10))为0.3 ng/m L。选择白菜、生菜及橘子为样品进行添加回收实验,样品经Qu ECh ERS净化后稀释20倍可消除基质效应,添加回收率在88.9%～117.4%之间,变异系数(CV)在6.2%～16.3%之间。该方法灵敏度高,样品前处理方便,可用于杀螟硫磷的快速筛查。     

呋喃它酮代谢物间接竞争酶联免疫检测方法的建立

目的建立呋喃它酮代谢物5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone,AMOZ)间接竞争酶联免疫检测法。方法通过衍生化反应制备了人工抗原CPAMOZ并用活化酯法将其与鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)连接成为包被原CPAMOZ-OVA。对包被原和单克隆抗体的最佳工作浓度、封闭液浓度、竞争时间、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗(horseradish peroxidase labelled goat antimouse Ig G conjugate,HRP-Ig G)、孵育时间和显色反应时间进行优化,并对方法灵敏度、特异性、精密度和准确度进行方法学评价。结果最优条件下,包被原和单克隆抗体稀释倍数分别为500倍和2000倍,封闭液浓度为2%,竞争时间为30 min,二抗孵育时间为30 min,显色时间为15 min。所建立标准曲线的对应线性方程是Y=-0.439X+0.670(r~2=0.992),IC_50为2.439 ng/m L,线性范围为0.506~11.765 ng/m L,回收率为86.7%~90.1%,批内和批间变异系数分别为1.4%~5.8%和2.1%~4.9%。结论该方法特异性强,准确性、精密度和重现性良好,可用于对AMOZ的快速筛查。