水产品三种致病菌多重PCR检测方法的建立

根据副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的耐热直接溶血素基因(tdh)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的耐热核酸酶基因(nuc)和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的侵入关联蛋白基因(iap)分别设计引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了对3种菌的多重PCR检测方法.结果表明:3对引物能特异性地扩增出202 bp、484 bp和714 bp的目的片段.优化后的多重PCR反应体系为:10×PCR buffer(Mg2+)2.5 μL、200 μmol/L dNTP、2 mmol/L Mg2+、模板2 μL、2.5 U Taq酶,引物浓度分别为:副溶血弧菌200 nmol/L、金黄色葡萄球菌40 nmol/L、单增李斯特菌320 nmol/L,总反应液25 μL.对贝类模拟样品的检测结果显示,应用多重PCR技术对3种菌的检测限分别为副溶血弧菌2.3×102 CFU/mL、金黄色葡萄球菌2.5×101 CFU/mL、单增李斯特菌1.5×103 CFU/mL.作者通过多重PCR技术实现了对副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的同时检测,具有快速、灵敏度高、特异性强等优点.     

冻虾类海产品中3种致病菌的多重PCR快速检测技术的建立

建立快速检测冻虾类海产品中沙门氏菌(Salmonella typli)、副溶血性弧菌(Vibrio parahae-molyticus)和单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的多重PCR方法。根据3种致病菌的靶基因,分别设计了3对引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了三重PCR检测虾类海产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生李斯特菌的方法,实现了对这3种致病菌的同时检测。该方法操作简单,检测周期短,具有灵敏度高、特异性强等优点,能够快速地实现对海产品中多种致病菌的诊断和监控。     

多重PCR快速检测三种食品病原菌

建立一种快速、经济、实用的可以同步检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)的方法。根据金黄色葡萄球菌的nuc基因,沙门氏菌的invA基因,小肠结肠炎耶尔森氏菌的ail基因,分别设计了三对引物,对单个基因PCR和单管多重PCR扩增进行特异性、灵敏性实验以及优化反应体系。三对引物能特异性扩增出236、475、127bp的目的条带。建立的多重PCR同时对3种食源性致病菌进行检测具有较高的灵敏度,灵敏度金黄色葡萄球菌为102CFU/mL、沙门氏菌为102CFU/mL、小肠结肠炎耶尔森氏菌为102CFU/mL。初步建立能同步、简便、快速、灵敏地检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的三重PCR方法。     

食品接触材料中3种致病菌的多重荧光PCR检测

建立并优化食品接触材料中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和副溶血性弧菌3种致病菌的多重实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,评价此方法的特异性和灵敏度,并模拟阳性样品进行检测。结果显示,该方法特异性良好,检测灵敏度均能达到10~3 CFU/mL,为食品接触材料的微生物检测提供技术保障。     

海产品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单增李斯特菌三重荧光定量PCR检测方法的建立

目的:建立一种同时定量检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌的三重PCR方法。方法:依据霍乱弧菌CTX遗传单元中zot毒力基因;副溶血性弧菌TDH中tl基因;单增李斯特菌hly基因,设计特异性引物探针,建立和评价了检测试剂盒性能。结果:霍乱弧菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌浓度在10~2~10~5cfu/m L标准曲线线性相关系数分别为0.9998、0.999、0.9963。三种致病菌10~5cfu/m L与10~3cfu/m L两种检测浓度对数值,批内变异系数分别为0.40%、0.83%、0.49%与0.75%、0.81%、0.64%;0.76%、1.03%、0.62%与1.06%、0.72%、1.26%;0.62%、0.51%、0.81%和1.38%、0.76%、2.34%;批间变异系数分别为0.58%与0.76%;0.83%与1.01%;0.66%与1.58%。检测灵敏度分别为:23、16、35 cfu/m L。结论:本文所建立的检测试剂盒适合于海产品等产品中三种致病菌的快速筛检。      

多重PCR法对乳制品中3种致病菌的同时快速检测

通过调整混合培养基的配比摸索乳制品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌的快速共增菌条件,并选择稳定高效的细菌基因组DNA提取方法,然后根据三种目标致病菌的保守基因分别设计多重PCR引物,对致病菌进行多重PCR检测.结果表明,方法具有良好的针对目标致病菌的特异性,检测限可达102mL1.且反应体系各组分间未见交叉干扰.对人工污染的乳品盲样检测验证了方法的实用性.     

食品中金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌和副溶血性弧菌的MPCR法检测

为快速检测食品中的金黄色葡萄球菌(SA)、单增李斯特氏菌(LM)和副溶血性弧菌(VP),根据各菌的相关基因设计引物,分别扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因-nuc、单增李斯特氏菌溶血素O上的hlyA基因和副溶血性弧菌的热稳定直接溶血素基因-tdh,建立一种MPCR快速检测食品中致病菌的方法,结果表明,三条特异性扩增片段分别为279bp、 243bp和202bp,经DNA测序证明其序列与模板被扩增片段一致.该方法具有良好的灵敏性和特异性.     

通用引物多重PCR技术检测3种病原微生物

为寻找快速且准确的病原微生物检测方法,在普通多重PCR(polymerase chain reaction)技术的基础上研究一种新的通用引物多重PCR(universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR)技术。利用该技术对食品中主要的3种致病菌——大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门氏菌进行同时检测,经过单重PCR验证、二重以及三重UP-PCR反应条件和体系优化。结果表明,该方法的最低检测限为0.5pg目标DNA,复合引物和通用引物的加入量分别为2nmol/L和300nmol/L。此方法检测灵敏度高、病原菌检测限低,可在实践中应用。     

乳品中3种常见细菌多重PCR检测方法的建立

分别以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌标准株为样本,提取其DNA,以大肠杆菌的pho A基因、金黄色葡萄球菌的nuc A基因和沙门氏菌的inv A基因作为靶基因,建立可以同时检测这3种菌株的多重PCR方法。与国标法对照,探讨多重PCR技术检测乳品样品中3种细菌的灵敏性和特异性。结果表明,建立的多重PCR检测方法与国标法检测的结果一致,人工模拟试验结果稳定,多重PCR具有快速、敏感和特异性强的特点。     

多重荧光定量PCR法检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌

目的建立检测海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的多重荧光定量PCR体系。方法针对副溶血性弧菌tlh基因,沙门菌Ompc基因和单增李斯特菌hly基因设计引物和Taq Man探针,建立多重荧光定量PCR体系,进行特异性与敏感性研究;利用该体系检测海产品中的副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌。结果副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌可得到特异性扩增,而共存于海产品中的其他细菌均未见扩增曲线。敏感性试验显示,该体系对副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的最低检测限分别为72、40、80 cfu/ml。对舟山采集的150份样品进行检测,检出32份副溶血性弧菌、11份沙门菌、5份单增李斯特菌,与国标法检测结果一致。结论本研究建立的基于Taq Man探针的多重荧光定量PCR检测方法可以特异、灵敏、简单快速地实现对海产品中副溶血性弧菌、沙门菌和单增李斯特菌的检测。     

广东省江门市区2004-2008年食源性致病菌的监测

目的了解江门市区2004-2008年食品中沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌及肠出血性大肠肝菌(EHEC)O157∶H7的污染状况,确定上述致病菌可能污染的高危食品,为食源性疾病监测提供科学依据。方法依据国标方法,并按《广东省食源性致病菌监测计划》检测技术要求,对采集的食品样本分别进行沙门菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌及EHECO157∶H7分离、生化及血清学鉴定。结果从9类626份食品中,5年共检出致病菌54株,总检出率为8.63%。其中金黄色葡萄球菌3年检出14株,检出率最高为4.83%;其次为沙门菌5年检出23株,检出率为3.67%;单核细胞增生李斯特菌5年检出16株,检出率为2.56%;副溶血性弧菌5年中仅检出1株,检出率为0.16%;未检出EHECO157∶H7。以非定型包装熟肉、生肉类污染较为严重。结论应加强非定型包装熟肉和生肉类食品食源性致病菌污染的监测。     

舟山市2006-2008年食源性致病菌污染状况分析

目的了解舟山市市售食品中食源性致病菌污染状况及分布和高危食品种类。方法参照国家食源性疾病监测网工作手册进行。结果检测生畜肉、生禽肉、非定型包装熟肉制品、动物性水产品、蔬菜、海水鱼、淡水鱼、冷菜、鲜榨果汁等共511件,检出沙门氏菌3株,检出单核细胞增生李斯特菌5株,检出空肠弯曲菌3株,副溶血性弧菌68株。结论舟山市居民主要消费食品存在食源性致病菌污染,其中水产品和熟肉制品污染较重,应引起有关部门重视,并加强监督、检查力度,加大对食品卫生安全的宣传教育工作。     

丹东口岸2003-2005年进口海产品中3种致病菌的检验

目的掌握丹东口岸进口海产品中单核细胞增生李斯特菌、沙门菌和副溶血性弧菌污染情况。方法对丹东口岸2003-2005年进口的海产品3种致病菌的检验结果进行了分析。结果1965批进口海产品中检出不合格产品44批(2.24%)。其中32批(1.63%)检出单核细胞增生李斯特菌、6批(0.31%)检出沙门菌和6批(0.31%)检出副溶血性弧菌。不合格产品主要为冻章鱼、冻海螺、冻紫石房蛤、活河螺、冻河螺肉等。结论从丹东口岸进口的海产品3种致病菌的污染比较严重,特别是被单核细胞增生李斯特菌的污染最严重,海产品中冻章鱼和冻海螺被这3种致病菌的污染比较普遍。     

叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 将PMA-qPCR、高通量测序以及分子进化树构建技术相结合,应用于冷链食品中多种病原菌的快速检测、种属鉴定、亲缘关系确定与溯源分析工作。 建立冷链食品中多种病原菌的快速检测技术并完成金黄色葡萄球菌的溯源分子进化分析工作。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌等等5种病原菌5种病原菌为作为研究对象, 应用PMA-qPCRPMA-qPCR技术结合高温裂解法作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对验证qPCR结果,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。研发病原菌活菌快速检测方法并开展冷链食品中病原菌的抽样调查。在建立稳定高效的检测方法后,为了获得冷链食品中病原菌污染水平、分布数据以及污染来源,研究开展冷链食品中病原菌的抽样调查检测工作。在检测出金黄色葡萄球菌等并分离病原菌后,进一步通过多位点采样以及16S rRNA测序构建了葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子生物进化树,完成菌株种属鉴定采用构建分子进化树的方法以及完成金黄色葡萄球菌等病原菌的溯源分析工作。结果 本研究应用建立的PMA-qPCR成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰感染,病原菌最低检测浓度可达到1×103 CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在16小时内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,本研究共从随机采集的751份冷链食品中检出6162株病原菌,病原菌总体检出率为8.13% (6162/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。通过分子进化树的构建成功溯源了金黄色葡萄菌的污染来源并完成菌种种属定位。本研究还注意到经微生物检验一株疑似单核细胞增生李斯特氏菌阳性菌株,该菌株后续通过测序、序列比对以及分子进化树构建确定为英诺克李斯特菌,这充分说明高通量测序的重要性以及方法验证的必要性。结论 研究在国内率先将PMA-qPCR、高通量测序与分子进化树构建技术相结合,应用于应用本研究方法可以快速有效检测5种冷链食品中的冷链食品中多种病原菌检测分析与种属鉴定,并完成金黄色葡萄球菌的溯源分析,方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,研究方法与成果可以为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供全新的思路与方法。