牦牛肉组织蛋白酶L酶学特性的研究

以牦牛背最长肌为原料,从中提取组织蛋白酶L并对其酶学性质进行研究。结果表明,该酶水解专一性荧光底物Z-Phe-Arg-AMC的最适反应pH和温度分别为5.5和40℃,在pH5.0～6.0、40～50℃条件下酶活稳定性最高。最适酶促反应时间和底物浓度分别为30min和25μmol/L。金属离子Ca2+、Cu2+、Mn2+、K+、Fe3+、Fe2+、Zn2+均能抑制酶活。EDTA和EGTA对酶有一定的抑制作用,L-Cys和β-ME对酶起激活作用。     

芽孢杆菌B15胞外蛋白酶和淀粉酶的酶学性质研究

为探索芽孢杆菌B15胞外蛋白酶和淀粉酶在饲用酶制剂方面的应用,试验对其产酶情况及胞外酶的酶学性质进行了研究。结果显示,该菌株产蛋白酶和淀粉酶的最高酶活性分别为(181.9±3.5)U/mL和(50.2±1.6)U/mL。蛋白酶和淀粉酶的最适作用温度范围分别为40℃～50℃和40℃～70℃,最适作用pH值为7和5～7。蛋白酶和淀粉酶经40℃～50℃热处理,以及在pH值为5～9的缓冲液中较稳定。蛋白酶被EDTA所抑制,属金属蛋白酶,金属离子(10mmol/L)Mg2+和K+对其有激活作用,Fe2+有抑制作用,而Fe2+对淀粉酶有一定的激活作用。     

雅致放射毛霉3.2778羧肽酶性质及其活性中心结构的研究

固态发酵雅致放射毛霉菌株(Actinomucor elegans)3.2778得到羧肽酶粗酶液,以N-苄氧羰酰基-L-苯丙胺酰-L-亮氨酸(N-CBZ-Phe-Leu)为底物,采用镉-茚三酮法测定羧肽酶水解产物。结果表明:雅致放射毛霉3.2778羧肽酶最适作用pH值范围为6.5～7.2,最适作用温度范围在40℃～45℃,最适作用温度为40℃,在30℃～40℃具有良好的温度稳定性。0.99mmol/L金属离子中,Mg2+对羧肽酶活力表现出显著的促进作用,酶活提高37%;而Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+可以抑制绝大部分酶活,残留的相对酶活力约10%。9.1mmol/L金属蛋白酶抑制剂1,10-邻菲啰啉(OP)和丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)和二异丙基磷酰氟(DFP)均可以完全抑制该酶活性,同时,对巯基有修饰作用的蛋白酶抑制剂PCMB、DTT、碘乙酸和β-巯基乙醇对羧肽酶有强烈的抑制作用。因此,推断该酶可能是一种丝氨酸羧肽酶,其活性中心有丝氨酸残基和二硫键结构,酶活受Mg2+激活。     

云芝(Coriolus versicolor)木质素过氧化物酶(LiP)酶学性质分析

研究云芝(Coriolus versicolor)产木质素过氧化物酶(Lip)酶活力随时间的变化情况,以及温度、pH 值、金属离子及化合物对云芝LiP 酶活力和稳定性的影响,对该酶底物浓度效应和Km 值进行测定。结果表明：云芝培养12d,其酶活力最高,为72U/mL。该酶的最适温度为40℃,在30～40℃范围内稳定;最适pH 值为2.5,pH 值在2.0～3.5 较稳定;Zn2+ 对LiP 有激活作用,Na+ 对酶活力没有影响,Ca2+、K+、Mg2+、Mn2+、Cu2+ 及EDTA、SDS、β- 巯基乙醇都表现出抑制作用;Km 值为2.05 × 10-4mol/L。     

酒曲中高蛋白酶产生菌筛选及酶学性质研究

利用脱脂牛奶平板法从宋河酒曲中分离得到6株有明显水解圈的蛋白酶产生菌,其中水解圈直径与菌落直径之比最大为8.84,经鉴定为芽孢杆菌。以此菌种通过发酵培养提取出粗酶液,然后对该蛋白酶的酶学性质进行研究。试验表明,该蛋白酶的最适酶活力温度为40℃,在40℃～50℃热稳定性较好;该蛋白酶最适pH值为11.0,在pH值为9.0～11.0稳定性较好,在pH6.0条件下酶活力很快丧失;金属离子Fe2+对该蛋白酶有激活作用,Cu2+、Zn2+和Pb+有抑制作用,Mg2+、Ca2+和Li+对该蛋白酶酶活性影响不大。     

米根霉乳酸脱氢酶的特性研究

乳酸脱氢酶(LDH)是米根霉发酵生产L-乳酸中催化丙酮酸转化成L-乳酸过程的关键酶。本研究从米根霉As3.819中初步分离出乳酸脱氢酶,并结合发酵条件对其酶学特性进行了研究。结果表明,该乳酸脱氢酶的最适反应pH为7.4,最适催化温度为30～50℃。Mg2+、Ca2+对该酶有激活作用,K+、Zn2+对该酶有抑制作用。以NADH和丙酮酸为底物的米氏常数分别为7.22×10-4mol/L和1.24×10-3mol/L。     

中国蛤蜊内源酶性质的研究

研究了中国蛤蜊的肌肉与消化腺中内源酶的性质。结果表明:1中国蛤蜊肌肉中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H为7.0与9.0,可能存在同工酶;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Ca2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Cu2+在5mmol/L时,对酶活力有激活作用,随着浓度升高对酶活力有抑制作用;Mn2+在5~15 mmol/L时,对酶活力影响不大,在20 mmol/L时对酶活力有激活作用。2消化腺中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H 8.0;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Mn2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Ca2+在5 mmol/L时,对酶活力有抑制作用,随着浓度升高有促进作用。Cu2+在5~15 mmol/L时对酶活力有促进作用,当浓度为20 mmol/L时,对酶活力有抑制作用。3肌肉中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H 10.0;Mn2+、Ca2+对淀粉酶活力有促进作用;Pb2+在5~10 mmol/L时对酶活力有促进作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有抑制作用;Mg2+在5~10 mmol/L时对酶活力有抑制作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有促进作用;Cu2+在5 mmol/L时对酶活力有促进作用,随着浓度升高,对酶活力有抑制作用。4消化腺中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H为9.0;Ca2+在20 mmol/L时对淀粉酶活性有促进作用,低于此浓度有抑制作用。Pb2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+对淀粉酶活性皆有不同程度的抑制作用。     

热稳定酸性β - 葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

耐酸性黑曲霉菌株Aspergillus niger L.的菌丝体破碎液依次经过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤等步骤处理,获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶,SDS-PAGE显示其分子质量为125.7kD。β-葡萄糖苷酶水解对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷的最适pH值为3.0～4.0,最适温度为70℃,表观米氏常数(Km)值为2.35mmol/L,表观kcat/Km值为2.99×104L/(mol ·s);水解京尼平苷、水杨苷的表观kcat/Km值分别是1.26×104、1.37×104L/(mol ·s);水解活性受Mn2+的显著激活和Fe2+、Zn2+、Cu2+等离子的微弱抑制。该酶活性在pH2.0～8.3保持稳定;酶在65℃时保温60min,残余酶活达到了85%,是一种热稳定酸性β-葡萄糖苷酶。     

鲶鱼鱼鳃中血管紧张素转换酶类似酶的性质研究

以鲶鱼的鱼鳃为原料,用硫酸铵盐析法提取一种血管紧张素转换类似酶,采用反相高效液相色谱法对温度、pH、金属离子、抑制剂和米氏常数等酶学性质进行了研究。结果显示:温度对蛋白酶活性的影响非常明显,最适反应温度是40℃,在20~40℃之间稳定性较好;最适pH为9、pH8~11之间有较好的稳定性。Na+对蛋白酶有一定促进作用,Cu2+和K+对蛋白酶有强烈抑制作用。卡托普利对蛋白酶活性有强烈抑制作用。以马尿酸-组氨酰-亮氨酸为底物,在pH9,40℃时测得Km值为0.18 mmol/L,Vmax是1.57 mmol/min。     

胆固醇酯酶高产菌株的筛选及动力学性质研究

通过平板初筛和摇瓶复筛,得到一株胆固醇酯酶的高产菌株,研究了pH值、温度、底物浓度、一些有机和无机试剂对胆固醇酯酶酶促反应速度的影响。研究发现,胆固醇酯酶有较好的酸碱稳定性,pH值为5.0￣8.0;最适pH值和最适温度分别为pH7.0和40℃,该酶的动力学研究表明,对胆固醇亚油酸酯和胆固醇油酸酯都表现为典型的米氏规律,Km值分别为2.2×10-5mol/L3.1×10-5mol/L,同时研究了一些金属离子和有机化合物对酶活性的影响,发现Mg2+、EDTA对胆固醇酯酶有激活作用。     

气单胞菌属JH菌株脂肪酶酶学特性的研究

从JH菌体中提取脂肪酶,并在不同的反应条件下对其酶学性质进行研究。该脂肪酶最佳反应温度和缓冲液pH制分别为40℃和7．0。该酶具有较强的热稳定性和pH稳定性：经过30℃、40℃处理60rain仍然保持90％以上的酶活;用pH3．5～9缓冲液处珲该酶,仍然保持80％以上的酶活。Ca2＋、Mg2＋对该脂肪酶具有明显的激活作用,尤其是Mg2＋作用最为显著,与对照组相比提高了38．8％,Zn2＋、Fe2＋对该脂肪酶有显著的抑制作用,Cu2＋对脂肪酶的影响不显著。用双倒数法作图得到Vmax=2．13×10^-2mol／L,Km=0．639（mmol／mL）min-1。表面活性剂吐温-80对脂肪酶有促进作用。该菌株产生的脂肪酶町以往温和的反应条件下作用。     

米曲霉蛋白酶动力学特性的研究

研究了在不同底物浓度、温度和pH下米曲霉蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的动力学特性。在反应时间为10min时,最佳反应温度为50℃,最佳反应pH为9。实验表明米曲霉蛋白酶水解酪蛋白生成酪氨酸的反应符合米氏方程,根据实验数据回归得到温度为40℃时的速度方程为r=0.243CS/0.0282+CS,反应速度与氢离子浓度的关系为r=lgCH++3.14013/0.19759+0.05484(lgCH++3.14013)+(lgCH++3.14013)2。该蛋白酶在50℃下的失活规律符合双指数模型,相对酶活力与时间的关系为a=0.82531e(-0.02169t)+0.17469e(-0.41914t)。在4～50℃的范围内,蛋白酶水解反应的活化能Ea为30.67kJ。还研究了不同化学组分对蛋白酶活力的影响,发现10mmol/L的H3BO3和Mg2+对该蛋白酶有一定的激活作用,而EDTA、SDS、Zn2+、Mn2+和Sn2+对蛋白酶有明显的抑制作用,10mmol/L的H2O2对该蛋白酶的抑制作用不明显。     

青藏高原土壤低温产蛋白酶菌株的筛选及酶学性质研究

从青藏高原土壤样品分离保藏的菌种中筛选到低温条件下产蛋白酶菌株LS20-2,对其进行生理生化试验以及分子生物学鉴定,并对其发酵液进行酶学性质初步研究。结果表明,该菌被鉴定为皮氏类芽孢杆菌（Paenibacillus peoriae）,产蛋白酶的最适反应pH值为7.0,最适温度为40 ℃。在pH5.0～7.0之间、温度0～40 ℃时酶活稳定,金属离子Fe2+、Zn2+及Triten X-100能抑制蛋白酶活性,金属离子Mn2+及表面活性剂Tween-20、Tween-80能提高蛋白酶活性。     

利用玉米胚内源酶富集γ-氨基丁酸工艺条件的研究

以脱脂玉米胚为原料,利用其中的蛋白酶和谷氨酸脱羧酶(GAD)富集γ-氨基丁酸。通过实验确定的富集工艺条件为:脱脂玉米胚与磷酸盐溶液(0.06mol/L、pH5.7)比例1∶40(g∶mL),反应时间5h,温度40℃,pH值5.7;同时添加600μmol/LCa2+可将GABA产量提高到4mg/g,比未富集时提高了10倍。另外,通过添加底物L-谷氨酸进行反应,脱脂玉米胚与磷酸盐缓冲液(0.08mol/L、pH5.7)比例为1∶40(g∶mL),VB6和CaCl2的添加量分别为3mmol/mol(Glu)和15mmol/mol(Glu),脱脂玉米胚与L-Glu质量之比为45∶1,40℃下反应6h,Glu的转化率可达100%,GABA产量为15mg/g,比未富集时提高40倍。     

Partial purification and characterization of proteases from Norway lobster (Nephrops norvegicus) and their role in the phenolase activation process

Proteolytic activity in Norway lobster (Nephrops norvegicus) was studied. An improved separation and partial purification of the three proteases (designated as proteases I, II and III) was achieved from Norway lobster heads by a combination of acetone precipitation and DEAE-Sepharose CL-6B column chromatography.The purification achieved was 63-, 25- and 217-fold at pH 8.2, and 40-, 25- and 160-fold at pH 6.4 for protease I, II and III, respectively.With casein as substrate, protease III was most active at pH 8.2, whilst proteases I and II showed activity over a wide range of pH.Protease III was characterized as an alkaline Zn-serine protease as it was strongly inhibited by PMSF, soybean trypsin inhibitor, Co²⁺, Mn²⁺ and 1–10 phenanthroline. Protease I was strongly inhibited by p-benzoquinone, iodo-acetamide, heavy metals (Ag⁺, Cu²⁺) and 1–10 phenanthroline and was thus characterized as a Zn-thiol protease. Protease II was also inhibited by the same inhibitors as protease I (but to a lesser extent) and was characterized as a thiol protease.The molecular weights were determined to be 22.5, 45 and 42.5 kDa (with activity at 18 kDa) for proteases I, II and III, respectively.It was found that protease III activates phenolase at pH 8.2, whilst proteases II and I can activate phenolase at both pH 6.7 and 8.2.     

一种米曲霉耐盐蛋白酶的纯化及酶学性质分析

采用硫酸铵沉淀、Q-HP阴离子交换柱和Superdux 75凝胶柱等技术,从酱油大曲中纯化得到一种耐盐蛋白酶,经飞行时间质谱鉴定为钙蛋白酶RIM13,属于一种半胱氨酸蛋白酶。该蛋白酶的最适温度为50?℃;最适pH值为6.5;稳定温度为40?℃;稳定pH值为7.0;Mn2＋促进蛋白酶活力,Fe3＋、Fe2＋、Cu2＋、Ca2＋、K＋、Na＋抑制蛋白酶活力,以上金属离子对蛋白酶二级结构也产生不同程度的影响;米氏常数Km为2.43?g/L,最大反应速率Vm为103.09?mg/（L·min）。在5、10?g/100?mL和15?g/100?mL的NaCl质量浓度条件下,蛋白酶保留的酶活力分别为77.22%、54.39%以及41.15%。该蛋白酶在高盐度环境下保持较高的酶活力,因此具有潜在的工业应用价值。     

根霉胞内α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp.A01的菌丝体破碎液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了54.8倍,总酶活回收率达到27.3%,在SDS-PAGE上显示相对分子质量为85.6 ku的单一条带,凝胶过滤表明该酶表观相对分子质量为302 ku。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为55℃,表观Km值为(0.242±0.027)mmol/L,表观kcat/Km值为4.089×105L/(mol.s);对蜜二糖和棉子糖有弱的水解作用,水解速度依次为138.3μmol/(h.mg)、19.7μmol/(h.mg)。水解活性受Fe2+和Fe3+的显著激活,但受Mn2+、Cu2+、Hg+和Mg2+等离子的强烈抑制。该酶活性在pH4.0～8.2保持稳定,在50℃时保温90 min,残余酶活达到了48%。