双醛氧化纤维素固定化β-半乳糖苷酶

以双醛氧化纤维素为载体固定化β-半乳糖苷酶,研究了固定化酶的制备条件、微观结构及酶学性质,结果表明:固定化时间为4 h,[酶]/[载体]=1:15(g:g)时,固定化酶的活力最高为0.517 U/g。红外光谱和扫描电镜对固定化酶的微观结构研究表明,双醛氧化纤维素的醛基与β-半乳糖苷酶的氨基发生共价反应形成固定化酶。与游离酶相比,β-半乳糖苷酶经过固定化后热稳定性和耐酸碱性增强,米式方程分析表明,β-半乳糖苷酶经固定化后与底物的亲和力降低,固定化酶重复使用5次后,相对酶活力为63%。     

双醛氧化纤维素固定化木瓜蛋白酶及酶学性质的研究

以双醛氧化纤维素为载体固定化木瓜蛋白酶,研究了固定化酶的制备条件、微观结构及酶学性质。结果表明:固定化时间4h,固定化温度4℃,酶/载体=1:3000(g:g)时,固定化酶的活力最高为50.9U/g。红外光谱和扫描电镜对固定化酶的微观结构研究表明,双醛氧化纤维素的醛基与木瓜蛋白酶的氨基发生共价反应形成固定化酶。与游离酶相比,木瓜蛋白酶经过固定化后,热稳定性和耐酸性增强,与底物酪蛋白的亲和力降低,固定化酶重复使用5次后,相对酶活力为55.1%。     

环氧基载体固定化K.fragilis β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

采用悬浮聚合法制备了表面含有活性环氧基的载体,研究了初始酶浓度及反应时间对该载体固定化K.fragilis-β-D-半乳糖苷酶效率的影响,应用环氧基载体固定化酶催化合成低聚半乳糖,探讨影响低聚半乳糖合成量的因素.结果表明:制备的环氧基载体为单一分散、近似球形、粒径约为150～200μm的球体.初始酶浓度为4.0mg/m L,环氧基载体对K.fragilis-β-D-半乳糖苷酶的固定化量达到最大值,为69.8mg/g载体,初始酶浓度为3.0mg/m L时,固定化酶的活力回收率最大,约为70％.固定化的酶量随着固定化的时间增加而增加,固定化10h时酶量达到最大值.固定化K.fragilis-β-D-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖的最适底物浓度为150g/L,反应4h GOS的产率达到最大,为40g/L.     

β-半乳糖苷酶的固定化及其在乳清行业中的应用

利用海藻酸钠和壳聚糖2种固定化载体对2种β-半乳糖苷酶(Lactozym酶和源于米曲霉的β-半乳糖苷酶)进行固定化,研究了温度和pH对酶活力的影响、游离酶和固定化酶水解乳清中乳糖以及固定化酶的重复利用性。结果表明:与游离酶相比较,固定化酶在最适反应温度、最适反应pH,乳糖水解和重复利用性方面均有不同程度的变化,表现出良好的稳定性。相比之下,壳聚糖固定化酶比海藻酸钠固定化酶的效果好,其中壳聚糖固定化源于米曲霉的β-半乳糖苷酶效果更为突出,该酶的最适反应温度50℃,最适反应pH为3.0,在相同加酶量的条件下水解乳清2 h后,乳糖水解率为72.99%,重复利用6次后,乳糖水解率仍能达到68.58%,重复利用性高,减少成本。研究为利用固定化酶工业化水解乳清中乳糖奠定了一定基础。     

壳聚糖固定β-半乳糖苷酶及其应用稳定性研究

以壳聚糖微球为载体,戊二醛为交联剂,固定β-半乳糖苷酶对β-半乳糖苷酶的固定化条件及周定化酶的各种性质进行研究,确定酶固定的最适条件为:用pH6.5的P-E-M缓冲液浸泡10h,25℃壳聚糖微球与0.5%戊二醛交联12h以上,4℃下酶与壳聚塘微球固定12h以上,酶活力回收率可达67%.固定化酶的最适温度为40℃左右,最适pH7.0.通过双倒数法求回归方程,求得酶动力学参数Km值为0.613 mmol/ml.固定化酶稳定性好,可以重复使用.将该固定化酶应用于乳糖分解实验和作为柱层析介质连续分解乳糖,分批反应6批次,乳糖水解率保持在90%以上,连续水解20d,乳糖水解率仍然可保持在75%以上.     

β-半乳糖苷酶的固定化及其在制备低乳糖牛奶中的应用

利用海藻酸钠和壳聚糖两种固定化载体对三种β-半乳糖苷酶(Maxilact酶、Lactozym酶和来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶)进行固定化,研究温度和p H对酶活力的影响,游离酶和固定化酶水解牛奶中乳糖制备低乳糖牛奶,以及固定化酶的重复利用性。结果表明:与游离酶相比较,固定化酶在最适反应温度、最适反应p H、乳糖水解和重复利用性方面均有提高,表现出良好的稳定性。相比之下,壳聚糖固定化酶比海藻酸钠固定化酶的效果好,其中壳聚糖固定化Maxilact酶效果更为突出,该酶的最适反应温度为60℃,最适反应p H为7.0,在相同加酶量的条件下水解牛奶2 h后,乳糖水解率达99.93%,重复利用5次后,乳糖水解率仍能达到99.28%,重复利用性高,可以减少成本。此次研究为利用固定化酶工业化生产低乳糖牛奶奠定了一定的基础。     

海藻酸钙固定化β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖

研究了强化海藻酸钙固定化β-半乳糖苷酶的方法以及固定化酶的性质,并用于制备低聚半乳糖。研究表明,用海藻酸钙包埋、戊二醛进行交联、对β-半乳糖苷酶进行固定,方法简便、酶的活力回收率高。所得固定化酶强度和活力高,对热、pH值耐受范围较游离酶宽,最佳反应温度和pH与游离酶相同,且贮存稳定性好。以乳糖为原料,用海藻酸钙固定化β-半乳糖苷酶催化合成低聚半乳糖,随着时间的延长,低聚半乳糖合成率呈抛物线变化。在温度55℃、pH6.0、乳糖浓度40%、反应时间为30h时,低聚半乳糖的合成率达最大值36.37%。     

壳聚糖微球固定化β-半乳糖苷酶

以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂固定化β-半乳糖苷酶,通过单因素和正交实验探讨了固定化载体和固定化条件对酶固定化的影响。结果表明,固定化载体壳聚糖(脱乙酰度90%以上)的最适分子质量和体积分数分别为3×105和2%,制备的壳聚糖载体具有良好的成球性和机械强度。采用交联方式将β-半乳糖苷酶固定在壳聚糖微球上,在单因素试验的基础上,进行正交试验确定固定化条件为:交联剂戊二醛浓度和交联时间分别为10 g/L和1.0 h,酶浓度和固定化时间分别为1.5 mg/m L和12 h,最终制备的固定化酶的活力回收率达到70.5%。同时该固定化酶具有良好的储存稳定性和操作稳定性,具有一定的应用价值。     

壳聚糖固定β-半乳糖苷酶的研究

以壳聚糖微球为载体，戊二醛为交联剂，固定β-半乳糖苷酶，对β-半乳糖苷酶的固定化条件及固定化酶的各种性质进行了研究，确定了酶固定的最适条件为：用pH6．5的P—E-M缓冲液浸泡10h，25℃壳聚糖微球与0．5％戊二醛交联12h以上，4℃下酶与壳聚塘微球固定12h以上酶活力回收可迭67％。固定化酶的最适温度为40℃左右，最适pH7．0。通过双倒数求回归方程，求得动力学参数Km值为0．613μmol／ml。固定化酶稳定性好，可以重复使用。     

Sulfolobus solfataricus P2 β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的表达及固定化

研究室获得1株来源于Sulfolobus solfataricus P2的β-半乳糖苷酶突变体F441Y,该突变体具有转苷性高,热稳定性好的特点。研究中,成功将β-半乳糖苷酶突变体F441Y在枯草芽孢杆菌中进行重组表达,3 L发酵罐发酵80 h后胞内酶活达到76.5 U/m L。鉴于β-半乳糖苷酶为胞内表达,为提高酶的使用效率并降低酶的成本,以2%的海藻酸钠、1%的明胶混合作为固定化包埋载体,2%氯化钙为固化液,0.5%的戊二醛为交联剂对重组菌进行细胞的固定化,全细胞酶活回收率达到62%,将该固定化细胞进行乳糖的酶转化,优化酶转化条件后,低聚半乳糖的最高转化率高达55.1%。     

固定化β-半乳糖昔酶的催化特性研究

β-半乳糖苷酶经固定化后,其催化性能得到一定程度的改善。在各种反应条件相同的条件下,固定化酶的最适反应奈件与游离酶相比得到一定程度的拓宽：受反应温度变化的影响变小,pH从5．8～6．2扩宽至5．7-6．5;对乳糖的转化效率有了不少的提高,酶的稳定性也得到了加强。实验中固定化β-半乳糖苷酶重复使用28次,底物转化率均在45％以上,具备了一定实际应用能力。     

α-半乳糖苷酶固定化的研究进展

α-半乳糖苷酶催化α-半乳糖苷键的水解,可将豆制食品及饲料中的抗营养因子α-半乳糖苷类转化分解,改善营养成分使其易于消化吸收。近年,α-半乳糖苷酶的固定化更是成为研究的热点。作为固定化酶技术的重要组成部分,载体及固定化方法的选取在很大程度上直接影响着固定化酶的活性及稳定性。综述了近些年国内外有关α-半乳糖苷酶固定化方法、固定化载体材料的研究现状和发展趋势,以期对固定化α-半乳糖苷酶的酶活性及稳定性提高提供参考。     

基于乳糖水解酶的乳酸乳球菌乳糖代谢多样性研究

探究了磷酸-β-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶对乳酸乳球菌乳糖代谢的影响。通过对12株乳酸菌在以乳糖为单一碳源环境下的生长、产酸、乳糖代谢情况、β-半乳糖苷酶和磷酸-β-半乳糖苷酶活力及发酵液中残留半乳糖含量进行测定,了解不同菌株乳糖代谢的差异。结果表明,不同的乳酸乳球菌乳糖代谢能力存在显著性差异;β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为270～4 110 mg/L,而磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的菌株发酵液中半乳糖含量为40～900 mg/L;将磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌与嗜热链球菌复配,发酵液中半乳糖含量较嗜热链球菌单菌发酵时显著降低。磷酸-β-半乳糖苷酶活力较高的乳酸乳球菌有助于降低发酵乳制品中的半乳糖含量。     

嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因的克隆及其作为食品级筛选标记的研究

为研究嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)作为食品级筛选标记的活性及筛选稳定性,作者从嗜酸乳杆菌基因组中克隆β-半乳糖苷酶基因并在乳酸乳球菌中表达,通过X-gal显色筛选阳性克隆;用X-gal显色筛选方法将重组乳酸乳球菌传60代,并测定β-半乳糖苷酶酶活和比活力。结果显示:通过表达有活性的β-半乳糖苷酶和X-gal显色可成功筛选出阳性克隆菌株;对借助X-gal传60代后的重组乳酸乳球菌进行β-半乳糖苷酶比活力检测,与X-gal筛选的第二代相比没有显著差异(P=0.5920.05),与红霉素筛选比较也没有显著差异(P=0.8820.05)。由此可见,β-半乳糖苷酶基因作为筛选标记具有较好的活性和稳定性,为以β-半乳糖苷酶基因作为筛选标记的食品级载体的研究奠定了基础。     

茶叶中β-D-半乳糖苷酶活性分析条件的优化及其在不同季节、嫩度和品种间的差异分析

采用单因素和正交试验设计对茶叶中β-D-半乳糖苷酶的比活力测定条件进行优化。结果表明,茶叶中β-D-半乳糖苷酶1比活力测定条件为:以pH4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠为缓冲液,在60℃下反应7min。对不同茶叶品种、生长季节以及不同嫩度叶片中的β-D-半乳糖苷酶比活力进行分析。结果表明,乌龙茶与绿茶品种中β-D-半乳糖苷酶比活力差异明显,不同季节与不同嫩度茶叶叶片之间也存在较大变化。     

β-半乳糖苷酶的微生物细胞表面展示及其应用

β-半乳糖苷酶是一种在乳制品生产、医药、生化分析等领域得到广泛应用的酶制剂。商品化β-半乳糖苷酶多以游离形式存在,但游离的β-半乳糖苷酶制造过程复杂、稳定性低、易失活、有机溶剂耐受性差、重复利用率低,这些制约因素限制了β-半乳糖苷酶的进一步应用。将β-半乳糖苷酶通过基因工程技术固定在微生物细胞表面,该系统的优点有:1)在工业生产过程中,无需经复杂的分离纯化和固定化操作,成本低;2)稳定性高、有机溶剂耐受性强,既可用于反应条件温和又能满足复杂体系、反应条件剧烈的催化需求;3)拓展β-半乳糖苷酶在蛋白质工程研究、生物传感器制造等领域的应用。β-半乳糖苷酶表面展示所用宿主包括乳酸菌、酵母和芽孢,该文分别综述这3种宿主中β-半乳糖苷酶表面展示系统的研究进展及其在酶的生产、作为报告蛋白和全细胞生物催化方面的应用。     

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)HN7 β-半乳糖苷酶的耦合固定化及其性质研究

采用壳聚糖为载体,以戊二醛为交联剂,通过包埋-交联耦合固定化方法,固定巨大芽孢杆菌(Bacillusm egaterium)HN7β-半乳糖苷酶,研究固定化条件和固定化酶酶学性质。和游离酶相比,以壳聚糖为载体的固定化酶,热稳定性和酸碱稳定性提高。连续催化9批次后,固定化酶酶活仍能达到最初酶活的79%,固定化酶操作稳定性较好。     

鳞杯伞α-半乳糖苷酶的固定化及其对豆浆中低聚糖的水解作用

采用海藻酸钠包埋法和壳聚糖交联法固定化鳞杯伞产生的α-半乳糖苷酶,通过比较固定化酶和游离酶的最适pH、pH稳定性、最适温度、温度稳定性、保存时间及两种固定化酶对豆浆中低聚糖的水解作用及操作稳定性等,探究较适宜于鳞杯伞α-半乳糖苷酶的固定化载体。结果表明：鳞杯伞α-半乳糖苷酶最佳硫酸铵饱和度为80%;两种固定化方法酶活性保持率都达到了50%以上,且固定化酶的温度稳定性、pH稳定性、保存时间相比游离酶都有提升;比较两种固定化酶,壳聚糖固定化酶的温度、酸度稳定性及操作稳定性要优于海藻酸钠固定化酶,但保存时间和对豆浆中低聚糖的水解效率要低于后者,两种固定化酶重复使用3次后低聚糖水解率在85%以上,相比于海藻酸钠,壳聚糖更适宜作为鳞杯伞α-半乳糖苷酶的固定化载体。     

高产β-半乳糖苷酶植物乳杆菌的筛选及其酶学性质研究

β-半乳糖苷酶不仅能通过分解乳制品中乳糖解决乳糖不耐症问题,同时能通过转糖苷作用合成具有益生功能的低聚半乳糖。从8株植物乳杆菌中筛选出高产β-半乳糖苷酶菌株K2,比活力高达6620 U/g,并对β-半乳糖苷酶酶学性质进行研究。结果表明:β-半乳糖苷酶最适和最稳定的pH值为6.5,最适温度为60℃,而在40℃稳定性最强。Mg2+对β-半乳糖苷酶活力有明显促进作用,而Cu2+有强烈抑制作用,通过推导求得米氏常数Km,oNPG=1.15 mmol/L,最大反应速率Vmax,oNP=6.34μmol/(min.mg)。研究结果为具有解决乳糖不耐受症的植物乳杆菌微生态制剂的开发奠定了基础。     

耐热乳酸菌的筛选及其β-半乳糖苷酶性质分析

本研究从鸡粪样品中分离高产β-半乳糖苷酶的耐热乳酸菌,经16S r RNA序列鉴定,分离得到的6株菌株均为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)。初步分析分离菌株所产β-半乳糖苷酶,其最适p H均为6.5。热稳定性实验发现,菌株MF1567产生的β-半乳糖苷酶在55℃温育1 h,仍保持51.2%的酶活力。分析菌株MF1567的β-半乳糖苷酶氨基酸序列和蛋白质结构,发现该菌株中β-半乳糖苷酶Lac Z存在22个氨基酸替代,其二级结构α-螺旋的比例较高(26.5%)。结果显示,蛋白质一级和二级结构的改变可能是该酶具有较好耐热性的原因。