基于质谱多反应监测技术（MRM）的蛋白质定量策略及其在肝癌生物标志物研究中的应用

肝癌是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤,在中国占癌症死亡率的第二位,年死亡率约为20.37/10万^[1]。肝癌的早期发现是提高疗效延长患者生存时间的关键。寻找和研究特异性强、灵敏度高的肝癌生物标志物蛋白质作为肝癌的早期诊断或预警对于改善肝癌早期诊断率低的状况尤为重要。近几年来,基于质谱技术的蛋白质组学发展加快了生物标志物的研究进程^[2]。采用差异蛋白质组技术,通过比较健康和疾病状况下的蛋白质表达量变化,能获得大量与肝癌发生、发展相关的生物标志物候选蛋白质。然而,从这些候选蛋白质列表中,筛选与疾病发生发展更为密切的生物标志物,确证其在临床检测中的特异性和灵敏度却成为目前生物标志物研究流程中的瓶颈^[3]。传统的生物标志物确证的主要方法是基于免疫学原理的Western-blot和ELISA,由于特异性抗体获取困难制备周期长,使大量生物标志物候选蛋白质确证工作受到限制^[4]。而发展基于质谱MRM技术的蛋白质生物标志物候选蛋白质的定量验证策略,不需要进行特异性抗体的合成,为解决验证工作的瓶颈提供了一种新思路^[5]。 Vitronectin蛋白和clusterin蛋白在各种恶性肿瘤的发生、发展中起到重要作用,并且也有研究报道认为这两种蛋白质在血清中的表达水平与肝功能受损密切相关。在本研究中,通过采用18O稳定同位素标记方法合成肽段内标并结合MRM质谱检测技术,建立了一种方便快捷的蛋白质绝对定量方法并用于以上两种生物标志物候选蛋白质在肝癌血清中的定量确证。首先针对血清样品干扰组分多和动态范围宽的特点,优化质谱MRM检测条件,引入丙酮沉淀技术改善样品预处理步骤,设计优化的液相色谱分离条件,最终满足了多个血清样本的高通量测定要求。然后,考察了定量方法的可靠性,包括特异性、精密度、准确度、预处理回收率、测定重复性以及定量线性。方法学验证结果显示,在0.4~40 fmol•µL^－1的浓度变化范围内定量测定线性相关性良好,r2值大于0.99。蛋白质最低定量限为0.4 fmol•µL^－1。精密度RSD＜11.96%,准确度RE%＜20%。预处理回收率大于87%,测定重复性RSD＜6.87%。最后,采用建立的方法进行了20例临床血清样本的检测,其中10例健康血清,10例肝癌血清。两组定量数据的统计分析采用非参数统计方法Mann-Whitney检验。在血清样品中测定的vitronectin 和clusterin浓度变化区间分别为 48.28~265.45 mg•L^－1和49.41~136.93 mg•L^－1。统计结果显示两种蛋白质在肝癌组血清样品中浓度呈下调变化（p＝0.049;p＝0.002）,为进一步开展大样本的临床验证提供了基础。     

电喷雾电离质谱及其在蛋白质化学研究中的应用

本文介绍了电喷雾电离质谱并综述其在蛋白质化学研究中的应用.由于电喷雾电离质谱可产生多电荷峰,因此扩大了检测的分子质量范围,同时灵敏度较高,另外它可与HPLC及高效毛细管电泳分离技术联用,扩大了质谱在蛋白质化学研究中的应用.     

质谱在金属抗癌药物与蛋白质相互作用研究中的应用

研究细胞毒性金属抗肿瘤药物与蛋白质的相互作用,以及这种相互作用对药物的细胞摄入、转运、代谢和生物利用度的影响,对金属抗癌药物的结构设计和优化,提高药物的抗癌活性,降低毒副作用具有重要意义。基于软电离技术的电喷雾质谱和基质辅助激光解析电离质谱能够在分析检测过程中很好的保留金属抗癌药物与蛋白质的共价(配位)结合,获得药物与蛋白质结合位点的信息。同时,质谱分析还具有灵敏度高,所需样品量少,耗时短以及适用于分析复杂生物样品等优点,已成为研究金属抗癌药物与蛋白质相互作用最强有力的工具,在为药物发现提供大量化学、生物信息的同时,也极大地促进了质谱技术自身的发展。本文将结合我们在金属抗癌药物相互作用组学研究中取得的最新进展,系统地总结、评述Bottom-up和Top-down质谱分析方法在铂、钌类金属抗癌药物与蛋白质相互作用研究中的发展动态,并分析这一前沿交叉领域未来的发展趋势。     

生物质谱在蛋白质药物分析研究中的应用

生物制品药物已经成为近年来快速发展的一类新兴药物领域,包括人用预防药物和治疗药物。蛋白质和多肽是生物制品药物的重要活性物质之一。与化学药物不同,蛋白质药物具有分子量大、结构复杂多变的特殊性,因此其理化性质更加多样,杂质成份不确定性高,发生免疫反应的可能性大。为确保药物的安全性和有效性,针对蛋白质药物自身的特点,依据国内外相关标准,建立一系列配套齐全的蛋白质药物分析方法和质量控制技术具有非常重要的意义。本文对生物质谱技术（Bio-MS）在蛋白质药物结构鉴定和翻译后修饰分析中的应用进行了系统介绍,力图通过重组尿激酶原（rhProUK）、重组人促红细胞生成素（rhEPO）和凝血因子X激活剂（RVV-X）等药物分析实例,提供一些可以借鉴的蛋白质药物分析的生物质谱技术方法。     

质谱与蛋白质（肽）的序列结构测定

文章归纳了历史上蛋白质（肽）序列分析方法的发展过程，介绍了质谱在蛋白质序列分析中的应用以及近年来运用化学和酶解方法同质谱联用，使蛋白质序列分析方法更通用、快速、灵敏和廉价。     

离子迁移谱-质谱技术及其在蛋白质糖基化研究中的应用

糖基化是生物体内重要的蛋白质翻译后修饰（PTM）。基于质谱的检测技术,特别是液相色谱-质谱（LC-MS）联用技术是糖基化研究的常规手段。然而,由于糖基化存在复杂的异构现象,大多数基于质谱的分析技术在区分其异构体时存在困难。离子迁移谱（IM）是一种基于离子在气相中的形状和电荷进行分离的技术,能够为质谱分析提供新的分离维度。离子迁移谱-质谱（IM-MS）技术具有较强的区分异构体的能力,在蛋白质糖基化研究中的潜力越来越受到重视。本文总结了IM-MS技术的类型和基本原理,及其在蛋白质糖基化研究中的进展,如对完整糖蛋白、完整糖肽和聚糖的研究,并展望了其应用前景。     

离子—分子反应及其在质谱分析中的应用

利用离子—分子反应 ,不仅可以提供分子离子峰 ,而且可以提高检测的灵敏度 ,了解分子的结构特征。本文根据离子—分子反应的机理 ,介绍了金属离子的亲和力的测定方法和金属离子在化合物上的加合位点 ,并阐述了离子—分子反应在化学电离质谱 ( CI-MS)、碱金属离子化学电离质谱 ( ACI-MS)、电喷雾电离质谱 ( ESI-MS)、快原子轰击质谱 ( FAB-MS)、以及基质辅助激光解吸电离质谱 ( MALDI-MS)中的应用     

机组状态灵敏监测技术及其应用（续）

四、灵敏监测技术的应用 上海炼油厂２＃催化主风机组、气压机组以前一直没有在线状态监测系统,仅凭定期用 Ｂｅｎｔｌｙ １０８ＤＡＩ数据采集器离线监测是远远不够的。我们与深圳创为实测控技术有限公司合作,在２＃催化裂化装置检修期间,先后安装了两套Ｓ８０００网络化在线灵敏监测及分析系统。该系统利用工厂光纤局域网络,采用Ｍｉ－ｃｒｏｓｏｆｔ　Ａｃｃｅｓｓ数据库和ＳＯＬ　Ｓｅｒｖｒ交换数据,在机组现场设置监测工作站,对现场信号测量模块进行管理和对现场机组数据进行采集、预处理及显示。在网络上安置一台中心分析站（…     

在线质谱在氢气准确定量中的应用

本研究建立了在线质谱仪准确测定氢气浓度的定量分析方法。通过对内、外管路和真空腔进行清洗,以及增加清洗气通道,优化了在线质谱仪进样清洗方法。通过单通道和多通道切换检测不同浓度的氢气,对仪器的性能进行了考察。优化清洗系统解决了氢气易返回不易抽走的问题,确保了检测结果的准确性。氢气的检出限达到0.001%,在0.005%~5.000%的浓度范围内线性关系良好。该方法可以广泛应用于氢气含量快速、多位点同时监测。     

二-(4-羟基丁基)四甲基二硅氧烷的质谱分析

以二甲基二氯硅烷、四氢呋喃和金属镁粉为原料 ,合成二 -(4-羟基丁基 )四甲基二硅氧烷。在轰击电子能量分别为 70、3 0和 1 0 e V的情况下 ,用色谱 /质谱联用仪对其结构进行了质谱测试分析。结果表明 :没有检出该化合物的分子离子峰 ,但多次检测均发现有 (M+3 )峰存在 ,且 (M+3 )峰绝对强度随电子能量的下降而减小 ,甚至消失     

质子转移反应质谱法测量呼气丙酮的影响因素分析

丙酮是人体呼出气体中含量最高的挥发性有机物之一,它与糖尿病、肺癌等疾病有着一定的关系。本研究通过注射法配制了不同二氧化碳浓度和湿度下的丙酮混合气体,应用质子转移反应质谱（PTR-MS）法对Tedlar采样袋中的丙酮混合气体进行浓度检测,研究二氧化碳浓度、气体湿度、氧气离子浓度和一氧化氮离子浓度等因素对丙酮浓度测量结果的影响,并推导出修正公式。结果表明：二氧化碳浓度和气体湿度的增加不会对丙酮离子的计数值产生明显影响,但会增加水合氢离子团簇离子的含量;氧气离子浓度的增加会提高丙酮碎片离子的含量;一氧化氮离子的测量浓度很低,对丙酮测量结果的影响可以忽略不计;以上各影响因素在使用修正公式后,可以有效地抑制影响,优化实验结果。     

MARVELD1基因功能产物的亚细胞定位及功能分析

MARVELD1基因是在非小细胞肺癌细胞系中存在差异表达的一个新基因,本文中我们将对MARVELD1蛋白的亚细胞定位及其功能作用做进一步的研究。运用免疫胶体金技术和重组荧光蛋白定位对MARVELD1蛋白进行亚细胞定位,观察发现MARVELD1蛋白在细胞核的核质中具有明显的标记信号,在胞浆中主要是在线粒体中有金颗粒存在。根据转染后细胞表面超微结构的变化结果,用FITC-鬼笔环肽对F—actin染色,激光共聚焦扫描显微镜观察结果显示,NIH3T3-MARVELD1细胞的微丝结构出现了明显的改变：微丝减少,细胞间通讯连接消失或降低,细胞膜边缘卷翘、皱缩,微丝变得紊乱、松散。说明该基因的表达影响了微丝的组装情况。应用间接免疫荧光技术对微管的分析表明在形态学上没有明显改变。根据微丝变化的形态学特征,采用半定量RT—PCR、western—blot进一步分析转染MARVELD1前后NIH3T3细胞中的纽蛋白（vinculin）和连接蛋白43（connexin43,Cx43）的表达情况。结果表明,转染后细胞中vinculin与Cx43的表达显著降低。表明MARVELD1基因的表达影响了细胞的粘附与细胞间通讯连接。鉴于MARVELD1亚细胞定位结果,提示MARVELD1蛋白的功能作用是通过核内调控vinculin与Cx43的表达机制,影响了微丝的结构,细胞粘附和细胞间通讯。     

热裂解气相色谱／质谱法分析油漆

本文应用美国CDS—190型裂解装置与FinniganMat1020GC／MS仪联用,对国产十七种不同牌号的油漆成膜物进行了分析,并采用“特征裂解产物”鉴定多种聚合物法,确定了各受试油漆的特征裂解产物。样品量仅需1～2μg。很适于交通事故现场提取物证的检验。     

质谱鉴定磷酸化蛋白研究进展

蛋白磷酸化是真核细胞中信号传导最主要的方式。为了理解信号传导过程 ,知道不同条件下蛋白质中磷酸化蛋白的总量和位点至关重要。基于质谱分析磷酸化蛋白 ,对样品富集、磷酸化位点的找寻以及磷酸化蛋白定量的各种方法及最新进展进行了详细报道与评述     

睾酮与表睾酮空间构象的化学反应质谱

本文采用反应质谱（Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ＲＭＳ）方法研究了睾酮（１７β－Ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ａｎｄｒｏｓｔｅｎ－３－ｏｎｅ）和表睾酮（１７α－Ｈｙｄｒｄｘｙ－４－ａｎｄｒｏｓｔｅｎ－３－ｏｎｅ）的质谱行为。并对不同的反应试刘做了比较。发现了样品与反应试剂发生的分子离子反应，产生的特征离子（Ｍ＋Ｓｉ（ｍｅ）３－Ｈ）＾＋反映了样品不同空间构象的差别。由分子离子丰度对特征     

大气压化学电离质谱分析苯二苯硫醚异构体

芳香性苯基硫醚是用于合成具有生物活性的含硫杂环物质的重要前体化合物。本工作采用大气压化学电离（APCI）/离子阱二级质谱技术结合量子化学密度泛函理论计算,对邻、间、对苯二苯硫醚三类位置异构体的质谱裂解反应机理进行研究。苯二苯硫醚三类位置异构体经过碰撞诱导解离（CID）,发生HS自由基和苯硫自由基的中性丢失;并且仅在邻苯二苯硫醚类化合物中可观察到连续中性丢失2个HS自由基产生的碎片离子,而在间、对苯二苯硫醚类化合物中则观察到S₂的特征丢失;取代苯硫酚的中性丢失只能在邻、间苯二苯硫醚类化合物中检测到,此外,间苯二苯硫醚类化合物还有取代苯的特征性丢失。综上,三类苯二苯硫醚位置异构体在APCI-MS/MS条件下的质谱裂解行为有显著差异,根据HS自由基、S₂、取代苯硫酚和取代苯的特征丢失,可实现这些异构体的区分鉴定。     

环己烷氧化副产物全组分的质谱分析

本研究建立了利用多种质谱技术分析表征环己烷氧化副产物的方法。将环己烷氧化副产物在减压条件下切割为馏程小于300 ℃的轻组分与馏程大于300 ℃的重组分。利用全二维气相色谱-飞行时间质谱法（GC×GC-TOF MS）对轻组分中的54种含氧有机物进行定性与半定量分析,发现轻组分主要是由酮类、醚类与醇类组成。利用傅立叶变换-离子回旋共振质谱法（FT-ICR MS）对重组分的分子组成进行表征,发现重组分中基本是O.2～O.5类的含氧有机物。重组分中化合物的碳数随O原子个数的增加而增加,但双键相等数（DBE）的分布却基本不变,从而推测重组分中可能同时含有环烷环、C=C、C=O以及醇、醚类C-O键等多种官能团。利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）技术验证了质谱分析结果的可靠性。本工作可为含氧有机物混合复杂体系的分析研究提供新的思路。     

除草剂阿特拉津气质联用色谱的测定

阿特拉津又名莠去津,是由瑞士Basel Geigy化学公司开发的一种广泛使用的均三嗪类除草剂,用于玉米、高粱、甘蔗、果园、草皮场和林地等的阔叶杂草和禾草的防除。农田中大量投放的水溶性较强的阿特拉津也是在各国河流、小溪等水体中检出率最高的除草剂。实验表明,长期低剂量的阿特拉津作用有诱发人类染色体破裂与生殖系统疾病的危险,也是水生动物种类大量减少的主要原因。     

基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱鉴定鲨鱼硒结合蛋白

利用基质辅助激光解吸电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)高置信度地鉴定了原核表达的白鳍鲨硒结合蛋白。实验表明,硒结合蛋白肽段之一被错误指认为胰酶自水解峰和混合谱是影响其未进行串联质谱分析或不能被数据库搜索匹配的主要原因,同时还发现,虽然赖氨酸结尾肽段在MALDI源中信号强度普遍很低,但对它们进行串联质谱分析也可获得较好的谱图质量,部分数据可用于从头测序。考虑以上因素后,硒结合蛋白鉴定覆盖率由35%增至51%。