食品中弓形菌16S rRNA特异性扩增检测方法的建立

针对弓形菌16SrRNA基因合成1对引物,通过对聚合酶链式反应(PCR)扩增条件的优化,建立了检测弓形菌的PCR方法。3株弓形菌标准菌株PCR产物测序结果与NCBI上公布的弓形菌16S rRNA基因序列进行比对,比对结果表明3株弓形菌测序结果与NCBI上公布的弓形菌16S rRNA基因序列同源性均在99%以上。3株弓形菌标准菌株均特异性地扩增出了长度为1202bp的片段,其他19株不同种类的菌株均无扩增产物出现。55份食品样品用Johnson-Murano肉汤增菌后用此法进行检测,其中6份样品为弓形菌阳性,阳性率为10.9%。上述实验结果表明,方法特异性强、操作简便,节省了检测时间,可用于食品中弓形菌的快速检测。     

新疆伊犁牧区传统手工奶酪中微生物多样性及其功能分析

为探究新疆伊犁牧区传统手工奶酪中的可培养乳酸菌和细菌多样性,首先采用Illumina MiSeq高通量测序技术对细菌16S rRNA基因的V1～V3可变区进行测序分析,结果显示：14 份奶酪中共存在493 种细菌属和780 种细菌种,其中奶酪中的优势细菌属和优势乳酸菌属为雷尔氏菌属和乳杆菌属,优势乳酸菌种为瑞士乳杆菌,且奶酪中还存在致病菌。在此基础上,利用传统培养法从MRS培养基中筛选出68 株可培养疑似乳酸菌,经生理生化实验及16S rDNA序列同源性分析技术对其进行属种鉴定。结果表明：68 株疑似乳酸菌分别为短乳杆菌、融合魏斯氏菌、屎肠球菌、粪肠球菌、耐久肠球菌、鸟肠球菌、棉籽糖肠球菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌,其中融合魏斯氏菌为奶酪中的优势乳酸菌种。在乳酸菌的属种鉴定上,传统培养法能够更准确地将乳酸菌鉴定到种水平。奶酪微生物基因COG功能预测结果显示：奶酪中的微生物富含与氨基酸转运和代谢有关的基因。将各个样品的微生物群落组成与功能组成进行比较,发现各个样品的细菌群落组成虽存在明显差异,但其功能组成却具有高度相似性。     

山西老陈醋和怀仁醋酒精发酵阶段细菌菌群多样性分析

为了探明山西老陈醋酿造工艺和怀仁醋酿造工艺对细菌菌群的影响,该研究利用高通量测序技术对两种工艺酒精发酵阶段样品（分别编号为S和X）的细菌菌群多样性进行分析。结果表明,S样品的细菌菌群多样性更高。两种工艺酒精发酵阶段样品的细菌菌群组成差别较大,与S样品相比,X样品中相对丰度较高的乳杆菌属（Lactobacillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、乳球菌属（Lactococcus）均增多,片球菌属（Pediococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、泛菌属（Pantoea）、链霉菌属（Streptomyces）、短状杆菌属（Brachybacterium）、肠杆菌属（Enterobacter）和非培养细菌（uncultured bacterium）均减少。导致两种工艺酒精发酵阶段样品有显著差异的细菌在S样品中为片球菌属、明串珠菌属、链霉菌属和泛菌属,在X样品中则为乳杆菌属、魏斯氏菌属和乳球菌属。相关性分析结果表明,乳杆菌属、泛菌属、魏斯氏菌属和片球菌属与其他物种联系紧密。     

真空包装低温熟牛肉中腐败菌的分离与鉴定

为研究真空包装低温熟牛肉中腐败菌的种类和特性,利用细菌常规培养方法,根据菌株的菌落形态、颜色等特征,挑选差别较明显的12株菌。通过扩增核糖体DNA限制性分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)以及16S r DNA序列比对分析确定菌株的分类地位,并结合菌株形态和生理生化鉴定确定12株菌所属的种。结果表明:所选取的12株菌中,3株为绿色魏斯氏菌,2株为枯草芽孢杆菌,2株为巴黎链球菌,2株为粪肠球菌,1株为解淀粉芽孢杆菌,1株为特基拉芽孢杆菌,1株为嗜冷杆菌属的Psychrobacter urativorans。其中绿色魏斯氏菌是导致样品变绿的主要原因。     

麻竹笋腌制过程中细菌群落动态变化分析

为了解麻竹笋腌制发酵过程中细菌群落的微生态演变情况,采用细菌16S r DNA的V3可变区的PCRDGGE技术监测6%Na Cl腌制麻竹笋的细菌群落组成和优势菌群的动态变化。经发酵液中细菌基因组DNA提取、巢式PCR、二次DGGE、切胶回收、测序及序列比对,共得到10条明显条带,分别鉴定为绿色气球菌、乳球菌属、食窦魏斯氏菌、魏斯氏菌属、噬甲基菌属、嗜盐嗜碱菌属、未培养细菌、乳球菌属、乳酸乳球菌、厌氧芽孢杆菌属和芽孢杆菌属。其中,发酵前3 d优势菌为绿色气球菌,7 d后优势菌为食窦魏斯氏菌和乳酸乳球菌。     

PCR-DGGE技术检测速冻饺子馅料中微生物区系

以速冻饺子为研究对象,对速冻饺子冻前的微生物多样性进行研究分析,为速冻饺子馅料的存放期限及防腐技术提供参考,避免后期出现卫生问题。利用传统分离培养的方法,对饺子肉馅中的细菌进行分离,得到30株纯菌株。通过菌株形态学鉴定、基因组DNA提取、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增及16S rDNA测序及序列比对分析来鉴定菌株的属种、构建种群结构进化树。结果表明:30株纯菌株中有14个属,22个种,优势菌分布在γ-变形菌纲中的假单胞菌属。     

利用16S rRNA序列鉴定分离自芽菜中的芽孢杆菌

从宜宾芽菜中分离优势菌群,选取4株芽孢杆菌,分别为B1、B2、B3、B4.对4株菌的16S rRNA基因经PCR扩增测序,将测序结果同该属内菌株的16S rRNA序列作多序列比较,并建立芽孢杆菌属的系统发育树.结合细菌形态学生理生化特性鉴定结果,结果表明菌株B1、B3为枯草芽孢杆菌,菌株B2为解淀粉芽孢杆菌,菌株B4为乙酰微小杆菌.     

新疆特色干酪中乳酸菌的分离鉴定

从新疆不同牧区采集工艺不同的干酪制品,对其中的乳酸菌进行分离纯化、生理生化性质试验和16S rRNA分析.结果表明,分离、纯化出的104株乳酸菌种,有82株为乳杆菌属(Lactobacillus),12株为肠球菌属(Enterococcus),10株为魏斯氏菌属(Weissella).利用16S rRNA序列同源分析和系统发育树分析对具有不同生理生化特性的代表菌株进行了分子鉴定,鉴定结果为TNM-2与干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、Y5-4与食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)、NS2-2与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的同源性达到100％,NM-2与瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、Y1-1与马乳酒乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)、WG与耐久肠球菌(Enterococcus durans)的同源性达到99％.     

阪崎克罗诺杆菌的16S rDNA鉴定分型

阪崎克罗诺杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种重要的食源性条件致病菌,易引发新生儿、早产儿、低体重新生儿和免疫力低下的婴幼儿产生严重的脑膜炎、菌血症和坏死性小肠结肠炎。本研究以分离自不同来源、通过生化鉴定的37株阪崎克罗诺杆菌作为研究对象,利用16S rDNA基因测序的方法对阪崎克罗诺杆菌进行鉴定和分型。结果表明:ES4并非为阪崎克罗诺杆菌,说明采用16S rDNA基因测序进行阪崎克罗诺杆菌的鉴定更为可靠;通过构建系统发育树分析,分离菌株位于同一系统发育分支;根据序列同源性比对,可将这一分支下的所有菌株分成7个子群,这表明16S rDNA基因测序可以对阪崎克罗诺杆菌进行分型,进一步揭示其系统发育关系。     

一株耐受蛋清蛋白的鸡蛋腐败菌S菌株的分离鉴定及其De novo测序分析

本实验采用传统微生物培养法从鸡蛋中分离出一株革兰氏阳性腐败菌S菌株,经形态学观察、生理生化分析及16S rDNA序列比对,对其进行了鉴定,并构建系统发育树。采用抑菌圈法及存活率试验探究该菌株对蛋清环境的耐受性,并基于Illumina HiSeq测序平台对该菌株的全基因组进行了De novo测序,获得基因组框架图。结果表明,该菌株生理生化反应特征与皮生球菌属相似,且16S rDNA序列与Dermacoccus abyssi(登录号AY894323)的同源性高达99%,鉴定为深渊皮生球菌(Dermacoccus abyssi)。该菌株在含有蛋清或溶菌酶的试管中能生长,在添加了蛋清或溶菌酶的孔径中没有抑菌圈产生。对蛋白编码基因的功能注释结果显示,细菌参与膜转运、离子结合、氨基酸和碳水化合物代谢及能量转换相关的基因丰富,推测其在鸡蛋中可能通过调节相关基因来耐受蛋清抑菌环境。该菌株对蛋清及溶菌酶的耐受性,为其在鸡蛋中的存活提供了有利条件。     

四川牦牛奶和曲拉中九株乳酸菌的分子鉴定

为准确鉴定分离自我国四川鲜牦牛奶和曲拉中9株乳酸菌到种水平,作者运用16S rDNA序列分析、recA基因特异扩增和hsp60-RFLP等多种分子技术对分离自我国四川地区鲜牦牛奶和曲拉中的9株乳酸菌进行分类鉴定。结果证实,16S rDNA序列分析法可将9株乳酸菌初步归类为植物乳杆菌群(4株),肠膜明串珠菌(4株),瑞士乳杆菌(1株)。由于16S rDNA序列分析法不能区分植物乳杆菌和戊糖乳杆菌,为了进一步鉴定植物乳杆菌群中的4株菌,继续采用recA基因特异扩增和hsp60-RFLP技术对其细分,结果表明recA基因特异扩增和hsp60-RFLP的方法均能很好地把植物乳杆菌群中的4株菌鉴定到种水平,且均为植物乳杆菌。     

水牛乳中可培养乳酸菌多样性分析

采用传统分离培养方法,从三品杂交生水牛奶混合样品中,分离出105株乳酸菌,通过形态、生理生化、API细菌鉴定系统及16S rDNA基因序列分析方法对各菌株属种进行鉴定。16S rRNA序列分析结果显示,105株菌共分为5个属8个种,呈现较为丰富的乳酸菌多样性,具体数量分布为乳酸乳球菌21株,植物乳杆菌19株,格氏乳球菌17株,乳明串珠菌13株,食窦魏斯氏菌11株,肠膜明串珠菌8株,类肠膜魏斯氏菌6株,嗜热链球菌5株,糊精乳杆菌5株。由此可知,水牛乳中可培养乳酸菌优势菌群的主次关系为：乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）＞植物乳杆菌（Lactobacillus plantaru）＞格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）＞乳明串珠菌（Leuconostoc lactis）＞食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）,此为后续开发水牛乳中优势乳酸菌资源提供了良好的理论基础。     

酱油发酵过程中细菌群落结构的动态变化

本文采用16S r DNA PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)指纹图谱和系统发育分析方法,以高盐稀醪发酵工艺生产的广东酱油为研究对象,揭示了酱油生产发酵过程中细菌群落结构的多样性及动态变化。从样品中提取总细菌DNA,用降落PCR扩增16S r DNA V3片段序列,再通过分析DGGE图谱选择特异性条带,进行割胶回收、测序及Blast分析。DGGE图谱表明,发酵初期样品具有丰富的微生物群落,但之后只有少数种类细菌存活,整个酱油发酵过程微生物群落结构的演变规律是由复杂到简单,这也说明酱油发酵环境具有抑制微生物生长的作用。测序结果表明,代表最相似菌为魏斯菌属(Weissella cibaria)和非培养的肠杆菌属(Uncultured Enterobacter sp.),其次是嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)、类肠膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)和肠杆菌属(Enterobacter sp.BF1-8)。     

中式熟食咸鸡主要细菌的分离与初步鉴定

采用嗜冷菌选择性培养基和含盐选择性培养基对咸鸡微生物菌群进行分离筛选。根据细菌的菌落形态、革兰氏染色反应等常见特征,由嗜冷菌选择性培养基分离出6 株菌C1～C6,含盐选择性培养基分离出4 株NaCl 胁迫条件下细菌S1～S4。提取单菌落DNA,对其16S rDNA 序列进行PCR 扩增后测序,结合形态、常规生理生化特性初步鉴定为：松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)C3,土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)C6,不动杆菌属(Acinetobacter sp.)C1、C2、C4、C5;日勾维肠杆菌(Enterobacter gergoviae)S1,表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)S2、S3,假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)S4。     

新疆阿勒泰地区酸奶疙瘩中乳酸菌的分离和鉴定

从新疆阿勒泰地区牧民制作的传统酸奶疙瘩中分离、筛选出菌株SA,通过过氧化氢酶试验阴性初步确定其为乳酸菌,对菌株SA进行菌落和细胞形态、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析及系统进化树分析。结果表明,分离菌株SA与Weissella cibaria KACC 11862 AEKT01000037聚为一类,其同源性为99%,故将其鉴定为食窦魏斯氏菌（Weissella cibaria）。其最佳生长条件为40 ℃、pH 6.0,并且能够耐受3%的NaCl。     

白腐乳发酵过程中细菌群落演替规律研究

为解析白腐乳发酵过程中细菌的多样性,应用高通量测序和培养组学相结合的方法分析了前酵和后熟过程中细菌的变化规律,通过高通量测序分析白腐乳发酵过程中细菌16S rDNA V3-V4区基因序列。结果表明,白腐乳从前酵到后熟过程中细菌群落有较大变化,豆腐坯中的优势菌为乳杆菌（Lactobacillus）,毛坯中的优势菌为不动杆菌（Acinetobacter）,后熟45 d腐乳中的优势菌为明串珠菌（Leuconostoc）,后熟180 d腐乳中的优势菌为四联球菌（Tetragenococcus）;利用培养分离方法从腐乳发酵过程中部分样品分离鉴定出75株可培养细菌,包括融合魏斯氏菌（Weissella confuse）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）和耐久肠球菌（Enterococcus durans）等。     

Diversity of lactic acid bacteria in fermented brines used to make stinky tofu

Stinky tofu is a kind of fermented tofu with a strong odor. Although stinky tofu is a very popular snack in the Asian region, the community of microbes, and especially lactic acid bacteria (LAB), indigenous to the fermented brine from which it is made remains poorly described. We examined 168 isolates obtained from the original fermented brine (brine A) and two brines in which the hard tofu (brine B) and soft tofu (brine C) had been soaked. Through random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis for typing and 16S rDNA sequencing, 136 representative strains were identified as belonging to 7 genera and 32 species: Enterococcus (2 species), Lactobacillus (14 species), Lactococcus (3 species), Leuconostoc (6 species), Pediococcus (1 species), Streptococcus (2 species), and Weissella (4 species). The LAB composition of brine A was the most diverse: 19 different species were isolated, and 9 of them were classified as Lactobacillus species. The 16S rDNA sequences of 9 strains (6 from brine A and 3 from brine C) showed low values of similarity (below 98%) with currently known species by analysis using the FASTA software. Thus, a wide variety of LAB strains were associated with the fermentation of stinky tofu brines.     

云南撒尼地区乳饼及酸乳清中乳酸菌的鉴定及其生物多样性研究

本研究对采自云南省石林彝族自治县5个不同地点的25份撒尼山羊奶乳饼和5份酸乳清样品进行了乳酸菌的分离,了解乳酸菌的进化途径及各菌株间的亲缘关系。采用16S rRNA基因序列分析技术和传统理化特性研究相结合对乳酸菌种属进行鉴定,同时绘制乳酸菌系统发育树,对其序列进行分子系统发育分析。30份样品中73株乳酸菌疑似分离株进行属种鉴定,46株杆菌分离株归属4个不同属中的13个种,27株球菌分离株归属5个不同属中的9个种,其中植物乳杆菌和融合魏斯氏菌分别占所有分离株的19.18%和15.07%,是云南撒尼羊奶乳饼及酸乳清样品中的优势菌株,云南撒尼山羊奶乳饼及酸乳清样品中的乳酸菌既丰富多样,这可能与云南特有的地理、地貌和气候环境云南撒尼民族制作乳饼方法、凝乳时间、生活习惯、挤奶容器和卫生条件有关。     

A polyphasic approach in order to identify dominant lactic acid bacteria during pasta manufacturing

Using a polyphasic approach, we have isolated and identified, lactic acid bacteria (LAB) in samples directly collected from an artisanal pasta-making manufactory located in Puglia (South Italy). Samples were collected during several steps of pasta processing and LAB were isolated on MRS and M17 plates. Furthermore, strains were grouped in a total of eight species by means of randomly amplified polymorphic DNA (RAPD)-polymerase chain reaction (PCR) typing and 16S rDNA sequencing. The majority of strains were identified as belonging to Pediococcus pentosaceus and Enterococcus faecium species. The remaining strains were characterized and assigned to Weissella confusa, Pediococcus acidilactici, Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc citreum, Lactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum species. Strains were identified from all the analysed samples, and growth of LAB was monitored from extrusion to pre-heating steps.