纳豆激酶纤溶活性研究

通过制备纳豆提取液、纳豆激酶粗酶,对纳豆激酶纤溶活性进行研究。结果表明:纳豆激酶纤溶活性最适pH为8.0,pH6~10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

纳豆激酶分离纯化及纤溶活性研究

经过生理盐水浸提、(NH4)2SO4分级沉淀、Sephadex G-100凝胶层析等纯化步骤,从纳豆中获得层析纯的纳豆激酶,纯化倍数15.6,回收率10.2%,SDS-PAGE电泳显示为二个组分,分子量在29000左右。对其纤溶性质研究表明:纳豆激酶活性的最适pH为8.0,pH6～10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆生理盐水浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

纳豆激酶基因在酿酒酵母中的表达

目的:从纳豆芽孢杆菌基因组DNA中扩增纳豆激酶基因,以实现该基因在酿酒酵母中的表达.方法:通过PCR方法扩增纳豆激酶基因,利用DNA重组技术构建重组质粒pYES2-NK,转化酿酒酵母H158感受态细胞;经β-半乳糖诱导表达后,用纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性.结果:克隆到大小为1192bp的纳豆激酶基因,编码397个氨基酸;活性检测表明酿酒酵母发酵液的上清液具有纤溶酶活性.结论:纳豆激酶基因在重组酿酒酵母中实现了分泌表达.     

紫外分光光度法测定纳豆激酶体外纤溶活力

建立短时间、定量测定纳豆激酶体外纤溶活力的方法。在体外反应体系中制备血纤维蛋白底物,向体系中加入待测样品(纳豆激酶),进行纤溶反应。用紫外分光光度计测定纳豆激酶水解纤维蛋白后生成的可溶性产物的吸光值。由此对纳豆激酶体外纤溶活性进行定量测定并进行方法可行性分析。该方法具有较好的灵敏度、精密度和准确度,用时短,该方法适用于纳豆激酶体外纤溶活性的定量分析。     

纳豆激酶纤溶功能及其机理研究

以 2 0 %FeCl3制造兔颈动脉血栓模型 ,并将 18只日本大耳兔 ,随机分为 3组 ,即十二指肠注射NK高、低剂量实验组 (分别为 45 0 0UI/kg、2 5 0 0UI/kg)、生理盐水模型对照组。观察纳豆激酶粗酶液体外、体内溶解血栓的作用。体外试验表明 ,B N 12液体发酵粗酶液作用血凝块 10、2 2h后 ,溶解率分别为 78 2 3%、98 16% ,对照组分别为 2 1 43%、2 3 91% (P<0 0 5 ,P <0 0 1) ;动物试验表明 ,NK高剂量组给药 1、1 5h后 ,CT (P <0 0 5 )、PT (P <0 0 5 )、TT (P <0 0 1)和APTT (P <0 0 5 )均显著延长 ,给药 2h后ELT和Fig含量显著降低(P <0 0 1、P <0 0 5 ) ,FDP含量明显增高 (P <0 0 5 ) ,血浆D dimer呈阳性 ;低剂量组CT、PT和APTT各指标及Fig含量无显著变化 ,但ELT明显缩短 (P <0 0 5 ) ,FDP含量、TT值显著增高 (P <0 0 5 ) ,且血浆D dimer呈阳性。纳豆激酶在体内和体外均具有明显的溶栓效果 ,提高纤溶活性、增强抗凝作用是其溶栓机理之一。     

一种食源性纤溶酶(纳豆激酶)酶学性质的研究

纳豆激酶是一种新型食源性纤溶酶 ,具有易于提取 ,无任何毒副作用 ,溶栓效果好 ,体内作用时间长等特点。实验以新鲜制备纳豆为原料 ,经生理盐水浸提 ,硫酸铵分级盐析 ,SephadexG -10 0层析获得纯纳豆激酶活性蛋白。实验表明 ,该酶分子量为2 80 0 0Da ,等电点为 9,在 6 0℃以下 ,pH 5～ 12均较稳定 ,其最适反应pH为 8,最适反应温度为 45℃ ,Mg2 和Co2 离子对酶活有激活作用 ,而Cu2 、Zn2 和Al3 等离子对该酶有明显的抑制作用。纳豆激酶酶学性质的研究对开发纳豆激酶成为新型溶栓制剂具有重要的实践意义     

高纤溶活性纳豆食品的研究

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品,我们从酱豆、豆豉及纳豆中分离和筛选到5株有明显纤溶活性的芽孢菌株,其中NK-5菌株活性最高,故被用作纤溶活性纳豆生产菌。根据形态和生理生化特征以及DNA中G C含量,鉴定NK-5菌株为枯草杆菌(Bacillus substilis),该菌株的重要特点是产生强力纤溶酶和大量胞外粘质。后者经鉴定为r-多聚谷氨酸。用NK-5菌株试制的纳豆既有日本纳豆典型的感官特征和营养组成,还具有很高的纤溶活性,其酶活性在贮存中能保持稳定,故有很高的利用价值,可望开发成新型保健品。     

纳豆激酶稳定性的研究

纳豆激酶是一种新型溶栓酶 ,具有溶栓效率高、药效时间长以及无毒副作用等优点。实验研究了pH、温度、金属离子以及某些有机物质对该酶稳定性的影响。实验表明 ,该酶在 4 5℃以下和 pH 7～ 9范围内酶活相对稳定 ;Mg2 +和Co2 +离子对酶活有激活作用 ,而Cu2 +、Zn2 +和Al3+等离子对该酶有明显的抑制作用 ;牛血清蛋白、蛋白胨、明胶、甘油、丙二醇和海藻酸钠等能显著提高酶的耐热性 ,其中以明胶的作用最为明显。这些发现对液体酶的生产有重要指导作用     

纳豆激酶与豆豉纤溶酶酶学性质比较研究

研究对纳豆激酶和豆豉纤溶酶的酶学性质进行了分析和比较,结果发现,二者最适pH值范围和温度基本一致,分别为pH7.0~9.0、50℃;纤溶酶活性在60℃以上迅速下降;纳豆激酶在pH6.0~10.0、豆豉纤溶酶在pH7.4~12.0时稳定性好;Mg2+对2种酶均有激活作用,Mn2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+有不同程度的抑制作用,Cu2+的对纳豆激酶的有显著抑制作用。     

纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶发酵工艺控制及纤溶酶分析

基于摇瓶发酵优化结果,在10 L发酵罐中研究了纳豆芽孢杆菌TN-02产纳豆激酶的发酵控制工艺,分析了发酵产物中纤溶酶的组分纯度。在放大发酵过程中,考察了培养温度和主要碳、氮源的流加补充对产酶的影响,并利用卡那霉素抗性基因kan对纳豆芽孢杆菌TN-02中的纳豆激酶基因aprN进行了部分替换和插入失活,获得了aprN突变的重组菌TN-021。结果表明,通过温度的阶段性控制和甘油、胰蛋白胨补料发酵,获得纳豆激酶的最高表达量为13 978.3 U/mL,是摇瓶发酵最高表达量的1.8倍;在菌株TN-021的摇瓶发酵产物中未检测到纤溶酶活力,证明了纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌TN-02发酵产物中唯一纤溶酶。研究结果为纳豆激酶高水平发酵放大工艺控制奠定了基础,同时为纳豆激酶的品质分析方法提供参考。     

重组大肠杆菌发酵表达及代谢调控研究进展

作为应用最为普遍的蛋白质表达系统,重组大肠杆菌表达系统具有其他表达系统无法比拟的优越性.本文综述了大肠杆菌作为表达系统的特征,采用重组大肠杆菌表达的重组蛋白及生物化学产品概况,概述了表达载体中营养源诱导启动子、温敏型启动子及乳糖启动子3种不同类型启动子特点.另外分析了不同大肠杆菌宿主对碳源的代谢特征,乙酸代谢对大肠杆菌...     

Bacterial Fibrinolytic Enzyme Coding Sequences from Indonesian Traditional Fermented Foods Isolated Using Metagenomic Approach and Their Expression in Escherichia Coli

Fibrinolytic proteins play an important role in treatment of cardiovascular disease. This study aimed to express coding sequences of new bacterial fibrinolytic protein from Indonesian traditional fermented foods obtained by a PCR-based metagenomic approach and to test their biological activity. New amino acid variations were found in nattokinase (NAT) at several positions i.e. D41N and V192A from dried Tauco, V4F, D41N, and V192A from yellow Oncom but not in Douchy Fibrinolytic Enzyme (DFE) from Terasi. The NAT and DFE recombinant versions were overproduced in Escherichia coli BL21(DE3) using pET16b(+). Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis analysis showed all clones produced mature soluble fibrinolytic proteins of 28 kDa. All recombinant proteins displayed caseinolytic and fibrinolytic activities. In conclusion, metagenomic approach can be applied to obtain and to express coding sequences of new variant bacterial fibrinolytic protein as active soluble mature form in E. coli.     

Expression and Iron Storage Properties of Recombinant Human Ferritins in Escherichia Coli: Relevance for Functional Ferritins in Food Systems

Ferritin is an iron storage protein found in most living organisms. Human heavy chain (H-) and light chain (L-) ferritin were amplified from human heart cDNA library. Each ferritin gene was inserted down stream of the T7 promoter of bacterial expression, and finally four types of H-, L-, and co-expression vectors were constructed. Recombinant human ferritins were overexpressed and identified with SDS-PAGE and western blotting. The expression levels of recombinant ferritin proteins ranged about 29–36% of whole cell total protein. From atomic absorption spectrometry (AAS) analysis, the rate of iron uptake for H-ferritin was significantly faster than that for the HL-, LH-, and L‐ferritin, respectively. From AAS analysis, the levels of iron content in cells progressively increased in transformants with 0–30 mM ferric citrate in the media. Among these ferritin transformants, the highest amount of cellular iron was observed with H‐ferritin transformant. The total amounts of iron content in E. coli could be sequentially ranked as H-ferritin > HL-ferritin > LH-ferritin > L-ferritin > negative transformants. Expressed recombinant human ferritins indicated that their assembled subunits were able to store iron in the cells. The results of this study further enhances our understanding of iron uptake properties in vivo and suggest similar strategies for using food-grade ferritins for functional foods or iron-fortified food ingredients.     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达

以纳豆芽孢杆菌HL-1全基因组DNA为模板,PCR分别扩增编码信号肽、前导肽及成熟肽的前纳豆激酶原基因序列(pre-pro-NK),编码前导肽、成熟肽的纳豆激酶原基因序列(pro-NK)和只编码成熟肽的纳豆激酶基因序列(NK),构建了大肠杆菌表达质粒pET28a-NK表达前纳豆激酶原基因及大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pHT315-NK表达纳豆激酶原基因和纳豆激酶基因,实现了纳豆激酶基因在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中的表达,并进行了活性分析。     

重组大肠杆菌ZJGSU01高效表达内切几丁质酶的培养条件

目的:研究重组大肠杆菌ZJGSU01高效表达内切几丁质酶的最优化培养条件.方法:以内切几丁质酶活力为指标,对诱导剂的诱导时间、诱导剂的添加量、装液量和接种量进行优化.结果:接种量5%,装液量100mL/500mL,重组菌培养1 h.添加诱导剂IPTG的浓度为1.0mmol/L,有利于内切几丁质酶的表达.结论:通过上述条件的优化,可明显提高内切几丁质酶的表达量.     

在大肠杆菌中融合表达重组羧肽酶抑制剂

利用PCR技术扩增得到编码土豆羧肽酶抑制剂（carboxypeptidase inhibitor from potato，CPI）活性多肽基因，克隆于表达载体pGEX-4T-1的多克隆位点中，得到重组质粒pGCPI，测序后将重组质粒转化到受体菌Escherichia coli BL21中。重组菌经IPTG诱导表迭，超声波破菌后，通过谷胱甘肽sepheroseFF亲和层析柱一步纯化得到融合蛋白，纯度大于979，6。融合蛋白经凝血酶切割并分离除去谷胱甘肽-S-转移酶后得到纯度大于98％的重组CPI，ELISA鉴定产物具有免疫原性，体外检测表明其促进纤溶的生物功能与天然CPI无明显差异。     

通过串联启动子实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

本研究通过串联启动子方式实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800中的高效分泌表达。通过对几种现有报道的强启动子的比较并对其进行串联操作,确定生产纳豆激酶的最优启动子及纳豆激酶的最高产量。本研究首先在枯草芽孢杆菌WB800中成功构建五种含不同强启动子的重组质粒p SG101(P_(HpaII)),p SG102(PBcapr E),p SG103(Plux S),p SG104(Pgsi B)和p SG105(Pyxi E),实现纳豆激酶分泌表达,并对其纤溶活性进行测定。结果表明,启动子P_(HpaII)介导的纳豆激酶纤溶活性(110.80 FU/m L)明显优于其他四种启动子。通过对启动子P_(HpaII)进行多次串联,成功构建质粒p SG106(P_(HpaII)-P_(HpaII)),p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))和p SG108(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))。数据显示,菌株Bacillus subtilis WB800/p SG107(P_(HpaII)-P_(HpaII)-P_(HpaII))纳豆激酶产量最高为213.30 FU/m L,相比单个启动子P_(HpaII),提高了92.51%。通过对五种强启动子的比较以及对其进行串联操作,成功实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌WB800的高效表达,纤溶活性最高为213.30 FU/m L,与现有相关报道相比有明显优势。