呕吐毒素生物脱毒研究进展

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）又名呕吐毒素（VT）,是镰刀菌属（Fusarium spp.）产生的最常见的真菌毒素之一,广泛存在于谷物及其相关制品中,给世界粮食生产造成巨大经济损失,也给人类和动物健康带来重大威胁。目前,利用微生物和酶对DON进行生物脱毒的方法展现出良好的应用前景。很多真菌和细菌能够通过自身吸附或降解的方式在DON的脱毒过程中发挥作用。本文概述了食物中DON的发生、毒性作用及DON生物转化机制,对近年来利用真菌、细菌和植物进行DON脱毒以及脱毒材料的应用进行了较为详细的阐述,以期为食品和饲料中DON的生物防控提供参考。     

生物降解呕吐毒素的肠杆菌筛选与鉴定

呕吐毒素,又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON）,主要污染小麦和大麦等作物。为了筛选得到具有呕吐毒素降解能力的菌株,实验搜集了50份土壤,通过菌株的富集、筛选和纯化得到一株白色菌株,命名为W-D,该菌株能在无机盐培养基中以DON（20 μg/mL）作为唯一碳源进行生长。对分离得到的菌株进行DON毒素降解能力检测发现,在37 ℃、180 r/min下作用于60 μg/mL的DON,经过7 d反应降解率可达40.40%。对该菌株进行相关鉴定,发现该菌株为革兰氏阴性菌,显微镜下呈短杆状,扫描电镜观察菌株为形状不一的杆状结构,大小约为0.5×(1.0~3.0) μm。生理生化鉴定结果表明W-D基本符合肠杆菌的特征。对W-D的DNA进行PCR扩增16S rDNA得到一段长度约为1500 bp的片段,测序后进行同源性分析表明该菌株属肠杆菌Enterobacter,与阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae的亲缘关系最近。     

谷物中不可小觑的呕吐毒素

呕吐毒素是一种主要由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌与粉红镰刀菌产生的B型单端孢酶烯族化合物,因会引起猪的呕吐反应而得名。呕吐毒素广泛分布在粮谷类农作物中,在大麦、小麦、燕麦和玉米中含量较高,在水稻、高粱、黑麦中含量较低。呕吐毒素能抑制蛋白质、DNA和RNA的合成,对动物和人毒性效应广泛而明显。     

两款酶联免疫吸附试剂盒检测玉米呕吐毒素的性能评价

选取两款市售呕吐毒素酶联免疫吸附试剂盒进行性能研究测评,旨在了解市售呕吐毒素酶联免疫吸附试剂盒质量情况,指导此种试剂盒的选取和提高检测准确性.结果表明,两款试剂盒的检出限、定量限、回收率、重复性和一致性均能满足国内对玉米中呕吐毒素的检测要求,利用上述试剂盒能快速有效实现样品中呕吐毒素的高通量筛查.实际检测时,对于限量临...     

纳豆芽孢杆菌Bacillus natto 16-1对小麦粉中呕吐毒素的脱毒机制

采用酶联免疫吸附法(ELISA)及高效液相色谱—质谱(HPLC-mass spectrometry,HPLC-MS)检测纳豆芽孢杆菌Bacillus natto 16-1各细胞成分对小麦粉中呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)的清除效果及降解产物,探讨纳豆芽孢杆菌清除呕吐毒素的效果及降解机制。结果显示,培养5h后不同浓度的菌悬液、发酵上清液、全菌裂解液、粗提酶液以及细胞壁悬浮液,对DON清除率均在53%以上,其中不同浓度的菌悬液处理间存在显著差异,高浓度细胞壁悬浮液处理对DON清除率高达62.85%;培养10h后不同菌体成分对DON的清除率在57%以上,其中不同浓度发酵上清液、菌体裂解液以及细胞壁悬浮液处理间存在显著差异。除细胞壁处理组外,其他各组均可将DON降解为分子质量较小的物质。结果表明,纳豆芽孢杆菌Bacillus natto 16-1各细胞成分对DON均有清除作用,且这种作用在一定程度与细胞成分的浓度及作用时间有关;各细胞成分对DON的清除机制主要是生物降解作用,细胞壁可能是通过生物吸附作用来清除DON。     

呕吐毒素胶体金快速检测试剂盒的性能评价

胶体金快速检测越来越广泛应用于食品中真菌毒素的现场检测,研究从检测灵敏度、特异性、重复性及参比方法一致性方面对呕吐毒素胶体金快速检测产品的性能进行系统性评价,旨在为呕吐毒素胶体金快速检测试剂盒的选取和质量评价提供技术参考.结果表明,该胶体金快速检测试剂盒符合检测小麦和玉米中呕吐毒素含量的技术要求,适合大批量样品的现场快...     

小麦赤霉病源呕吐毒素的合成、检测及防控

赤霉病是主要由禾谷镰刀菌侵染小麦、大麦和其他小谷类作物而造成作物减产的世界性病害。小麦赤霉病发病需要高温和高湿的环境条件,感染程度及发病范围主要由寄主自身的抗性决定,对粮食产业以及人类健康的危害主要来源于籽粒中积累的呕吐毒素(deoxynivalenol, DON)。赤霉病需要多层次、全流程的防治,而降低DON毒素的危害是防治赤霉病需要重点突破的环节。本文概述了DON的合成过程、致病机制、检测方法和脱毒策略,并提出防治赤霉病的思路,重点挖掘与DON毒素诱导、运输和转化相关的基因资源,为通过生物育种途径培育DON低积累小麦品种、减少DON危害提供参考。     

降解呕吐毒素微生物的筛选鉴定及其应用

目的 筛选高效降解呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)的微生物并鉴定其种类.方法 分离培养出高效降解DON的微生物,鉴定该微生物种类,分析微生物各组分降解DON的效率,并在DON超标的小麦麸皮中开展应用.结果 筛选到高效降解DON的菌株MB-1,该菌株能降解82.3％的DON.鉴定结果表明菌株MB-1被命名...     

酶联免疫法检测呕吐毒素的方法研究

目的:利用抗呕吐毒素的特异性单克隆抗体和包被抗原,建立间接竞争酶联免疫法(ELISA)来检测谷物及其制品中呕吐毒素含量。方法:通过方阵滴定实验确定呕吐毒素最佳抗体浓度和最佳包被抗原浓度,应用酶联免疫测试盒对谷物及其制品中的呕吐毒素进行定量检测的方法学评价,来确立该方法的各项技术指标。结果:方法的最低检测浓度10μg/L;平均RSD为5.8%;回收率平均值为104%;用该方法研制的测试盒在4℃环境下可稳定6个月以上;检测时间小于2h;结论:该方法简便、安全、灵敏度高、重复性好、特异性强、能定性和定量检测谷物及其制品中的呕吐毒素含量。     

呕吐毒素降解微生物的研究进展

呕吐毒素在玉米、小麦和大麦等谷物和禽畜饲料中检出率很高,是污染最严重的霉菌毒素之一,严重危害食品安全.因此,如何高效安全地去除呕吐毒素成为研究的热点.相比传统的物理和化学处理方法,生物降解法因具有高效、对环境友好和特异性强等优势而广受关注.作者概述了生物降解呕吐毒素的方法,重点总结了降解菌株的种类、降解酶及其基因,并且...     

氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003膜结合乙醇脱氢酶的纯化鉴定和性质研究

通过超速离心收集膜组分、表面活性剂溶解膜蛋白、CM- 纤维素柱层析纯化等步骤,从氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003 中获得电泳纯的具有1,2- 丙二醇脱氢酶活性的脱氢酶,此酶由两个亚基组成,其表观相对分子质量分别为80000 和50000。经MALDI-TOF MS-MS 质谱分析与肽质量指纹图谱检索鉴定,证明纯化得到的酶是乙醇脱氢酶。酶学性质分析表明,该酶的最适反应温度为30℃,最适pH 值为5.5～6.0;该酶能催化多种一元醇、二元醇,但对包含3 个以上羟基的多元醇基本无氧化活性;其催化活性随着底物碳链长度的增加而减小;大多数金属离子及抑制剂(Cu2+、Fe3+、Ca2+、EDTA 等)对此酶活性均有抑制作用。     

米根霉乙醇脱氢酶粗酶液的特性研究

米根霉细胞中乙醇脱氢酶(ADH)催化丙酮酸向乙醇支路的转化,导致丙酮酸向乳酸转化通量减少,降低了乳酸转化率。本文初步从米根霉菌丝体中提取制备ADH粗酶液,并研究其酶学特性,结果表明,ADH粗酶液体系反应的最适温度为25℃,温度高于30℃将降低ADH活力。ADH催化体系pH值对其活力有很大影响,最适pH值在7.5左右,高于或低于此值,反应速度均很快下降。在反应体系中添加0.1μmol的EDTA、Mg2+、Ca2+或Zn2+,对该酶都有一定的抑制作用。ADH以乙醛为底物的米氏常数Km为6.90×10-4mol/L。     

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)直接竞争ELISA方法的建立

利用前期制备得到的DON酶标抗原(辣根过氧化物酶标记)以及抗DON抗体,建立检测食品中DON含量的直接竞争ELISA方法。该方法的检测范围1～100ng/mL,灵敏度达0.56ng/mL,半数抑制浓度IC50为10ng/mL;与DON类似物T-2毒素的交叉反应率为12%;玉米淀粉样品回收率在80.2%～91.1%之间,平均批间变异<15%,平均批内变异<3%。     

猪肝乙醇脱氢酶的分离纯化及部分性质

新鲜猪肝经匀浆、缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析及Superdex-200凝胶过滤层析,获得电泳纯的乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase,ADH）。纯化结果显示：该酶比活力为1 622.33 U/mg,回收率为29.05%,纯化倍数为34.58;该酶分子质量约为171.79 kD,亚基分子质量约为43.68 kD。ADH酶学性质研究显示：最适反应温度和pH值分别为45 ℃和10.0;在25～45 ℃及pH 7.5～9.0范围内稳定性较好;最适条件下测得该酶对乙醇的Km值为19 mmol/L;正丁醇、氯仿、异丙醇、十二烷基硫酸钠、草酸、Zn2＋、Cu2＋、Ag＋对该酶的抑制作用最强,Mg2＋对该酶有激活作用,EDTA对该酶有双重作用。     

(R)-1-苯基-1,2-乙二醇脱氢酶的纯化及酶学性质

高压匀浆破碎近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCCM203011)得酶粗提液,经乙醇沉淀、DEAE-Sephacel离子交换层析、SuperdexG-75凝胶层析及亲和(Cibacron Blue 3GA)层析纯化得到以NADP+为辅酶的醇脱氢酶,SDS-PAGE电泳鉴定为单一条带,纯化后比活力提高20倍.HPLC凝胶柱层析法检测相对分子质量为45 000,SDS-PAGE电泳测得相对分子质量为43 000,表明该酶为单亚基结构.以(RS)-1-苯基-1,2-乙二醇(简称苯乙二醇)为底物,该酶最适反应温度为45℃,最适反应pH值为8.0.金属离子中Mg2+对酶活的有一定激活作用.以纯酶催化转化消旋体苯乙二醇,该酶优先选择(R)型对映体为底物.     

嗜热厌氧乙醇杆菌组氨酸融合双活性乙醇脱氢酶的克隆、表达和酶学性质

乙醛脱氢酶和乙醇脱氢酶是嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacter ethanolicus乙醇代谢途径中的关键酶。根据高同源性的NADP(H)依赖型Ⅱ型乙醇脱氢酶(S-ADH)的序列设计引物,从T.ethanolicusJW200基因组中PCR扩增出编码S-ADH的基因,插入带组氨酸标签的pET-20(b),测序获得基因大小为1 059 bp,并在大肠杆菌JM109(DE3)中表达。表达产物经Ni亲和柱提纯达电泳纯。带组氨酸标签的重组NADP(H)依赖型乙醇脱氢酶具乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶双活性,能将乙酰辅酶A转化成乙醇.带组氨酸标签的重组酶酶学性质为乙醛脱氢酶活性最适值为pH 8.4,最适温度70℃;乙醇脱氢酶活性正、逆反应分别最适pH 8.0,最适T 55℃;最适pH8.9,最适为T 60℃。以乙酰辅酶A(Aceyl-CoA)为底物,该酶的Km为3.32 mmol/L,Vmax为12.5μmol/(min.mg)。T.ethanolicusJW200中双活性S-ADH的首次发现,建立了该菌乙醇代谢途径中从乙酰辅酶A到的乙醇的另一条通路。     

鸭肝谷氨酸脱氢酶的纯化与酶学性质研究

目的：获得鸭肝谷氨酸脱氢酶纯品并对其酶学性质进行研究。方法：采用丙酮脱脂、重金属离子沉淀、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose 离子交换层析和Sephacryl S-200 凝胶层析方法,分离纯化鸭肝谷氨酸脱氢酶,用SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯度鉴定和酶相对分子质量测定。结果：从鸭肝中分离纯化获得电泳纯的谷氨酸脱氢酶,纯化倍数为60.93 倍,酶活力回收率为11.02%,比活力达24.37U/mg。酶相对分子质量为371.41,亚基相对分子质量为61.60。推测该酶由6 个相同亚基构成。该酶对NADH 的Km 为53.19μmol/L,最适pH 值为10.0,最适反应温度为35℃。该酶在pH8.0 左右较稳定;在40℃以下酶活力保持稳定。Zn2+、Li+ 和Cu2+ 对该酶具有显著的抑制作用。结论：分离纯化获得谷氨酸脱氢酶,该酶具有较高应用价值。     

一株降解呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的筛选与鉴定

目的:分离筛选能够降解呕吐毒素(deoxynivalenol,DON)的芽孢杆菌,以用于该毒素的生物降解。方法:采集霉变秸秆、土壤和粪便样品,先将样品加热80℃后,取上清液接种到以DON为唯一碳源的分离培养基富集DON降解菌。以LB培养基分离纯化富集菌,然后对分离到的菌株进行DON毒素降解能力检测。对降解能力最强的菌株进行形态学观察、生理生化实验和16S r DNA序列鉴定。结果:从16株分离菌中筛选得到一株对DON降解能力最强的菌株B.JG05,降解率最高可达80.61%,且对含DON饲料的降解率为82.68%。该菌株呈短杆状,能形成芽孢;生理生化特性符合蜡样芽孢杆菌的基本特征;16S r DNA序列进化树分析表明该菌株与蜡样芽孢杆菌的亲缘关系最近。结论:筛选获得了一株高效降解DON的蜡样芽孢杆菌B.JG05,为饲料和食品中DON毒素的生物降解提供了可能。     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

牛肝谷氨酸脱氢酶的分离纯化及部分酶学性质

取新鲜牛肝,经匀浆、缓冲液抽提、正丁醇脱脂、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose离子交换层析、Superdex-200凝胶过滤层析等方法纯化,获得了电泳纯的牛肝谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,GDH）。经过纯化后的结果：GDH的酶比活力为306.06 U/mg,纯化倍数为93.60 倍,酶活回收率为23.12%。GDH的分子质量为380.2 kD,亚基分子质量约为61.7 kD。酶学性质研究结果表明：GDH的最适反应温度为50 ℃,在温度为30 ℃以下时较稳定;最适反应pH值为8.2,该酶对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NADH）的Km值为0.696 mmol/L。甲醇、乙醇、异丙醇、Cd2+、Co2+、Ca2+、Ag+、Pb2+、Zn2+、Cu2+对该酶具有抑制作用,低浓度Ba2+、Mg2+、K+、Li+与乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA）对其具有一定的激活作用。