天蚕素抗菌肽(Cecropin A)融合蛋白的表达及其分离纯化工艺研究

通过单因素实验确定了天蚕素抗菌肽融合蛋白表达的最佳条件,即温度为31℃,种子菌接种量为2.0％,培养基pH值为6.5,诱导时间为10 h,此时融合蛋白的表达量占细胞总蛋白的30.6％;开发融合蛋白纯化工艺,将工程菌细胞超声破碎后,所得包涵体使用8 mol/L尿素溶液溶解,泵入2 mol/L尿素溶液中搅拌使蛋白质复性,复...     

天蚕素抗菌肽发酵培养基优化

选用抗茵肽生产菌KJ02为出发菌,对其发酵培养基进行了研究并使用正交设计优化了发酵培养基。优化后的培养基：葡萄糖3％,蛋白胨l％,酵母膏2％,NaC10．5％。同时在500L中式水平上对该培养基的效果进行了试验,发酵液杀菌效价为13651IU／mL。     

抗菌肽cecropin P1在大肠杆菌中的融合表达及活性测定

目的 在大肠杆菌中融合表达抗菌肽cecropin P1.方法 根据抗菌肽ceeropin P1的氨基酸序列,依照大肠杆菌密码子的偏爱性,采SOE技术合成cecropin P1的编码基因;将其克隆至表达载体pET-32a(+)上,经IPTG诱导表达,超声上清液用Ni·NTA亲和层析初步纯化,经肠激酶切割后,用薄层平皿琼脂...     

鲎素Tachyplesin Ⅰ在大肠杆菌中的重组表达及其抑菌活性

为了高效制备抗菌肽,本文将鲎素抗菌肽目的基因Tachyplesin-1(TP1)在大肠杆菌BL21中进行表达。首先构建表达质粒pET32a-TP1并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行目的融合蛋白表达,并利用His标签与镍柱亲和层析对融合蛋白进行纯化。纯化后的融合蛋白经羟胺裂解液切割和质谱分析后,获得单一的TP1重组蛋白,最后对其抑菌活性进行表征。结果表明,重组菌在37℃经IPTG诱导后,融合蛋白表达成功,TrxA-TP1融合蛋白的分子量在20 kDa左右。经羟胺裂解得到的重组蛋白TP1对于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均具有良好抑菌活性,最小抑菌浓度分别为6和10 mg/L。本研究为鲎素抗菌肽TP1的开发应用和大量生产奠定了基础。     

多重PCR合成天蚕素基因及其在E.Coli中的克隆

天蚕素抗菌肤是食品领域中研究最多的昆虫抗菌多肤。通过对62种天蚕素低级结构的研究，设计出4条全新抗菌肤序列。应用多重PCR方法合成设计多肤的全基因序列，酶切PCR扩增产物和克隆载体puc19，构建重组质粒并将其转化到大肠杆菌中。测序结果表明目的片段已经成功克隆到宿主菌JM109中。     

杂合抗菌肽NK-LPd的设计、表达及抑菌活性评价

目的：了解杂合抗菌肽NK-LPd的抑菌活性,探讨进一步开发潜力。方法：用两个甘氨酸作接头连接NK-lysin和Piscidin的活性片段,生物信息学技术预测杂合抗菌肽的理化性质和功能结构,根据毕赤酵母（Pichia pastoris）的密码子偏好性优化杂合抗菌肽NK-LPd基因序列,重叠延伸聚合酶链式反应（gene splicing by overlap extension polymerase chain reaction,SOE-PCR）扩增基因并与分泌型表达载体pPIC9K连接,通过化学法将其转化至毕赤酵母KM71感受态细胞中,经0.5%甲醇诱导表达和亲和纯化后获得杂合抗菌肽NK-LPd,评价其抗菌活性。结果：成功构建了KM71/pPIC9K-NK-LPd,经诱导表达5 d后上清液中获得了相对分子质量约6 kDa的表达产物,与预期大小相符;抗菌活性实验表明,NK-LPd对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较强的抑菌活性,与母体肽相比,杂合抗菌肽NK-LPd的抑菌活性显著增强。结论：设计并在毕赤酵母KM71中分泌表达了杂合抗菌肽NK-LPd,其抑菌活性优于母体肽。本研究可为新型杂合抗...     

响应面法优化天蚕素抗菌肽培养条件的研究

目的:通过响应面分析方法对天蚕素抗菌肽培养条件进行优化。方法:以天蚕素抗菌肽生产菌株KJ05出发,使用Plackett-Burman和响应面分析法对天蚕素抗菌肽生产菌株KJ05进行培养条件优化,结果:从8个因素中筛选出3个显著因子:葡萄糖、起始pH和接种量,优化结果为葡萄糖含量为5.7%,接种量为5.6%,起始pH为6.4,优化后培养基所产的天蚕素抗菌肽平均杀菌效价达到12852U/mL,优化后培养基在500L发酵灌中所产的天蚕素抗菌肽杀菌效价达到15520U/mL。结论:优化后结果稳定,较优化前效价提高30.7%。     

新疆家蚕抗菌肽在酿酒酵母中表达的实时监测及活性分析

本研究对新疆家蚕抗菌肽在酿酒酵母INVSc1菌株中分泌表达过程进行了实时监测及活性测定。结果表明,选择培养基中酵母表现为典型的S型生长曲线;诱导培养基中酵母表现为波浪式缓慢上升的曲线,上升的时间和速度与酵母的初始接菌密度有关。诱导过程补加少量20%半乳糖诱导剂可以明显抑制酵母的生长,同时,酵母细胞平板计数结果也表明补加半乳糖使酿酒酵母出芽增殖减缓,菌落计数减少。研究发现诱导过程补加半乳糖不仅可以使发酵液中总蛋白的含量提高约50%,还可以使酵母分泌蛋白的时间提前。抗菌实验表明,抗菌肽对大肠杆菌抑菌效果较好,发酵液上清对大肠杆菌的最大抑菌圈直径为52 mm;对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较弱,最大抑菌圈直径为20 mm。      

自动诱导表达体系表达片球菌素融合蛋白

分别采用IPTG诱导和自动诱导方法诱导E.coli BL21（DE3）基因工程菌表达片球菌素融合蛋白;采用稀释方法对变性后的片球菌素融合蛋白包涵体进行复性,复性后融合蛋白经Ni-IDA柱分离纯化后经肠激酶酶切得目的片球菌素蛋白;以单核细胞增多症李氏杆菌为指示菌,采用牛津杯法测定所得到的片球菌素活性,并对其热稳定性,耐酸碱性和耐蛋白酶活性进行了分析。实验结果表明,经过诱导后,IPTG诱导菌液最终OD₆₀₀值为3.5000,而自动诱导为7.6998,IPTG诱导融合蛋白包涵体采用尿素溶解后的蛋白浓度为0.1001 mg/m L,而自动诱导为0.2359 mg/m L;自动诱导体系所获得的片球菌素融合蛋白产量优于IPTG诱导体系。所获得的片球菌素对单核细胞增多症李氏杆菌有抑制作用,热稳定性好,耐酸性强而耐碱性弱,对胰蛋白酶,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶和蛋白酶K敏感,可以被降解。自动诱导体系可以应用于片球菌素融合蛋白的E.coli BL21（DE3）基因工程菌高效表达片球菌素。      

Nisin-rbLF-N融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

针对乳链菌肽(nisin)抑菌谱窄的缺点,选择对抗菌谱较广且具有较强抗性的牛乳铁蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)为材料,构建融合基因Nisin-rbLF-N。将融合基因克隆到原核表达载体pGEX-4T1 中,转化E. coli BL21(DE3)进行诱导表达,将诱导表达的产物进行Tricine-SDS-PAGE 蛋白电泳及抑菌活性检测。结果表明,克隆菌经诱导后可表达出可观的融合蛋白,融合蛋白以包涵体形式存在,包涵体经洗涤、尿素溶解、复性后具有抗菌生物活性。     

抗菌肽基因在E.Coli JM109中的克隆表达

合成5条50～70 bp的DNA片段,用"片段拼凑"的方法通过三步PCR扩增得到目的基因,天蚕素基因被克隆到PUC19载体上,再转化大肠杆菌JM109.电泳分析重组质粒,确定天蚕素基因已转化到JM109上.摇床发酵转化子,IPTG诱导表达目的肽,最后提纯表达产物.SDS-PAGE电泳分析表明有特异性带出现,荧光色谱分析表明表达肽与目的肽组成一致,最后确定天蚕素在JM109中得到表达.抑菌圈活性实验表明,表达肽具有一定抗菌活性.     

基于抑菌活性的纳他霉素微孔板生物检测法

为快速测定大量纳他霉素样品含量,基于其抑菌活性建立了一种新型的微孔板生物检测法。结果表明,裂殖酵母AS2.637为最适敏感指示菌,优化的敏感指示菌初始浓度为105～106cfu/mL,纳他霉素样品加入时间为0 h,培养时间为8 h。微孔板中纳他霉素浓度在0.95～2.14 mg/L与抑菌率呈较显著的线性关系,微孔板生物检测法与HPLC法测定的结果无显著差异,该方法具有处理量大、操作简单、平行性好等特点,可用于发酵过程中纳他霉素产量的定量和突变菌的高通量快速筛选工作。     

Enhancement Antimicrobial Activity of Hyphothiocyanite Using Carrot Against Staphylococcus Aureus and Escherichia Coli

Hypothiocyanite has been known as antimicrobial agent that was generated from lactoperoxidase system (LPOS) but its antimicrobial activity was low against pathogenic bacteria in milk. This research has been done to enhance the antimicrobial activity of hypothiocyanite against pathogenic bacteria commonly found in milk: Staphylococcus aureus and Escherichia coli by addition of carrot extract. The result showed that carrot extract was able to enhance the antimicrobial activity of hypothiocyanite strongly against E. coli, however less enhancement has been found in the antibacterial activity of hypothiocyanite against S. aureus.     

酪蛋白磷酸肽、木糖醇等成分对乳铁蛋白抗大肠杆菌活性影响

乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白，具有多种生物活性功能。本文对酪蛋白磷酸肽(CPPs)、木糖醇、VC、低聚异麦芽糖等功能性食品常用成分对乳铁蛋白的抗大肠杆菌性能的影响进行研究。在研究过程中，通过对这些物质在不同浓度下对乳铁蛋白最小抑菌浓度影响变化比较，揭示了CPPs、木糖醇、VC、低聚异麦芽糖等成分对乳铁蛋白的抑制大肠杆菌作用的影响表观现象，结果表明木糖醇及VC对乳铁蛋白的抑菌作用有明显的增强作用。而CPPs和低聚异麦芽糖对乳铁蛋白的抑菌作用有减弱作用。     

牡蛎抗菌肽Molluscidin的密码子优化、重组毕赤酵母表达及抑菌活性

目的:利用重组毕赤酵母高效表达抑菌活性较好的牡蛎抗菌肽Molluscidin.方法:按照毕赤酵母密码子偏好性优化合成牡蛎抗菌肽Molluscidin,利用生物信息学方法分析其基本理化性质,经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后与表达载体pPICZαA连接,构建重组质粒pPICZαA-CgMoCo,电转至毕赤酵母X-33,利用博...     

大豆苯丙氨酸解氨酶(PAL)在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定

利用基因重组技术,克隆了大豆(Glycinemax(L.)Merr.)的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase,PAL)全基因,构建pET-GMPAL工程表达质粒,在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,并利用细胞裂解液得到的粗酶液转化L-苯丙氨酸生成肉桂酸。通过8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,获得了分子量在77.9kD的一条蛋白质特异表达带,特异蛋白质表达量达到总蛋白质含量的8%左右。通过初步发酵,获到具有PAL活性的粗酶液裂解液,粗酶的比活力达到211.7μmol/gpro·min(3529μkat/kg),高于红酵母PAL和欧芹重组PAL表达的比活力。结果表明克隆重组的大豆PAL基因通过表达质粒pET-GMPAL在E.coli中能高效地表达为有催化功能的高活力酶。     

Simulation of E. Coli Inactivation by Carbon Dioxide Under Pressure

ABSTRACT: ; Published isobaric semilogarithmic survival curves of E. coli were fitted with logS(t) = - b(P)t^n(P) where b(P) and n(P) are pressure dependent coefficients. Pressure profiles, P(t), were generated with a double logistic model and the corresponding inactivation rate is only a function of the momentary CO₂ pressure and survival ratio, then dlogS(t)/dt = - b(t)-n(t)-{-logS(t)/b(t)^{[n(t) −1]/n(t)}. This differential equation was solved numerically to produce nonisobaric survival curves, which demonstrated the effects of the pressure level, treatment duration, and the come up time. They also enabled theoretical comparison of processes consisting of single and multiple compression-decompression cycles of equivalent duration