转几丁质酶基因烟草遗传稳定性研究

从转几丁质酶基因烟草株系(NPTII基因是选择标记基因)对卡那霉素的抗性,及外源几丁质酶基因表达蛋白的活性(Western Blot检测)两个方面对转基因株系的遗传稳定性进行了分析研究。在卡那霉素抗性检测试验中,检测了13个T₂转基因株系,其中9个株系被检测种子100%对卡那霉素(100 mg/L)具有抗性;T₃和T₄转基因株系各检测了10个,100%被检测种子在含卡那霉素100 mg/L的MS培养基上长成了烟苗。Western Blot检测了11个T₂株系,检测结果表明,6个株系被检测植株100%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株80%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株50%含有外源几丁质酶蛋白,1个株系被检测植株19.05%含有外源几丁质酶蛋白。在温室内将转基因烟草与未转基因烟草密植在一起,种植2代,烟株开花期模仿自然风力对烟株吹风,进行了转基因烟草是否可以通过花粉进行基因漂移的研究。研究结果表明,在自然风媒条件下未发现转基因烟草可进行基因漂移。      

烟草CN基因的RNA沉默载体构建与功能分析

黄花烟HZNH是我国特有的地方种质资源,接种烟草花叶病毒(TMV)后表现出超敏反应和系统获得性抗性。目前,已从HZNH中克隆到1个同TMV抗病基因N基因同源的基因,命名为CN基因。为方便利用RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术研究烟草CN基因的功能,构建了用于RNAi的植物转化载体pPZYICN。通过农杆菌介导的叶盘法转化含N基因的烟草Xanthi-nc,获得了32株转基因植株,TMV接种后,转基因Xanthi-nc没有丧失对TMV的抗性,说明CN基因的RNA干扰载体不能沉默N基因的表达,故CN基因可能是HZNH中特有的抗性基因,从而为获得新的烟草抗病基因及抗病品种奠定基础。     

生物技术与我国烟草农业

烟草是最早应用于分子生物学和基因工程研究的植物之一,作为模式植物,对烟草的遗传性状、外源基因的合成和导入途径、载体的构建、基因的整合和表达、转化细胞的培养和植株再生以及优良株系的选育等,已经形成一整套较为成熟的技术流程,获得了一大批抗病、抗虫转基因烟草品种(系)。我国利用基因工程技术也已成功地培育出了抗TMV、CMV、PYV的烤烟和香料烟品种(系)。但是,由于多方面原因,转基因烟草在全球范围内一直未能像玉米、大豆等作物一样,在生产上获得推广应用。我国转基因烟草的研究工作目前也仅限于在实验室或严格控制的小环境下进行。21世纪生物技术发展将会更加迅猛,前景极为广阔。我国烟草生物技术研究和应用,将会对我国烟叶生产水平的提高做出积极的贡献      

农杆菌介导快速、高效获得转基因烟草纯合株系

利用植物表达载体PBI121空载体,对农杆菌介导法转化烟草技术体系进行了综合改进,探索激素配比、侵染时间、分化和生根培养阶段卡那霉素的筛选压对烟草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)植株再生和转化效率的影响;同时根据孟德尔显性性状杂合子自交后代遗传分离规律,在转基因株系后代扩繁时用卡那霉素筛选分离,可以在T2代较快得到纯合株系.本研究通过使用整个叶片浸染、高的卡那霉素筛选剂浓度、控制生长条件以及强化管理,极大地缩短了获得纯合株系的时间,确立了该烟草品种快速、高效获得大量转基因阳性植株及快速获得转基因纯合株系的转化体系,其转化周期可减少至5-6个月,转基因植株阳性率可达到90％,其中60％的转基因植株后代卡那霉素抗性性状分离比例接近3:1.     

打顶及仿生信号分子对烟草氧化胁迫的影响

打顶对烟草植株是一种创伤,为明确这种机械创伤是否对烟草植株形成氧化胁迫,测定了非打顶株及打顶株在打顶后一定时间内叶片组织中的超氧阴离子(O2-·)、过氧化氢(H2O2)、丙二醛(MDA)和超 氧化物歧化酶( SOD)的含量与活性,并分析了这些生化指标的变化;同时,在打顶后立即在烟株顶部涂抹仿生型信号分子BSM,测定了相关生化指标.结果表明:打顶能够激发烟草产生氧化胁迫;而外源BSM处理可以抑制打顶后烟草植株的氧化胁迫,减少了烟草叶片中O2-,H2O2,MDA的积累,SOD的活性增加,BSM是通过抑制氧化胁迫、减少了茉莉酸的合成,进而降低了打顶后烟草植株中生物碱的积累.     

银杏白果、叶、外种皮中生物活性物质含量比较分析

试验以乙醇、丙酮、60%乙醇和60%丙酮为萃取剂,采用高效液相色谱法对银杏白果、叶、外种皮中主要生物活性物质进行对比分析。结果表明,黄酮苷和萜内酯含量的大小顺序为:银杏叶(14.0 mg·g~(-1)和1.40 mg·g~(-1))外种皮(0.67 mg·g~(-1)和0.19 mg·g~(-1))白果种仁(0.17 mg·g~(-1)和0.073 mg·g~(-1));多糖含量的大小顺序为:外种皮(835 mg·g~(-1))白果种仁(76.8 mg·g~(-1))叶(26.3 mg·g~(-1));银杏酸含量的大小顺序为:外种皮(128.8 mg·g~(-1))叶(26.5 mg·g~(-1))白果种仁(2.1 mg·g~(-1))。白果种仁、叶、外种皮三者均含有丰富的K、Ca、Na、Mg、Fe、Zn元素。另外,4种萃取剂中,60%乙醇对黄酮苷、萜内酯和多糖的萃取测量值最高,而乙醇对银杏酸的萃取测量值最高。     

fps基因过量表达对烟叶类胡萝卜素生物合成的影响

为探索法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因过量表达对烤烟叶片类胡萝卜素生物合成的影响,利用RT-PCR技术,比较了4个fps转基因株系(K4、K-6、K-17、K-35)及其非转基因对照中参与类胡萝卜素生物合成的关键酶基因的表达强度,并利用LC/MS技术,分析了叶片发育过程中类胡萝卜素及其各组分含量的变化规律.结果表明:外源fps在烟草中的过量表达,对烟叶类胡萝卜素合成相关基因Psy、Lycb皆有正向调节作用,但对Zds的表达影响不大;化学分析表明fps转基因烤烟株系中,总类胡萝卜素及其各组分的含量在叶片不同发育期均高于未转基因K326对照株系.说明外源fps基因在烟草中的过表达,对类胡萝卜素生物合成具有促进作用.     

HAL1基因转化烟草提高烟叶含钾量研究

提取酿酒酵母总RNA进行RT-PCR反转录,根据HAL1基因(GeneID:856113)序列设计阅读框引物,对反转录产物进行PCR扩增,并进行全序列测定,构建筛选标记为带内含子的Km抗性基因的植物双元表达载体,经根癌农杆菌介导法将HAL1基因导入烟草品种龙江911和K326中,进行卡那霉素抗性筛选、GUS染色、目的基因扩增和HAL1基因mRNA荧光定量PCR检测,并对T1代各转化烟草材料烟叶含钾量进行化验分析。测序结果证实PCR扩增得到的DNA与酿酒酵母HAL1基因序列相同,获得抗卡那霉素、GUS阳性的转化植株12株。经PCR扩增检测证实HAL1基因已整合入转基因烟草的基因组,荧光定量PCR分析结果表明HAL1基因已在烟苗根系表达,烟叶含钾量化验结果证明HAL1基因可使烟叶含钾量提高30%。      

抗TMV烤烟杂交种KF118的培育

烟草花叶病毒 (TMV)及烟草花叶病毒的普通株系 (TMV- COMMON)可以造成韩国烤烟严重的产量和质量损失。对于防治 TMV大发生 ,栽培措施和化学药物都受到一定的制约。因而 ,最好的防治途径是培育抗病品种。在育种过程中 ,将抗 TMV的材料 TC175的抗性基因转育到其它栽培品种上 ,对     

一个与烟草TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记

烟草普通花叶病（Tobacco Mosaic Virus,TMV）是烟叶生产的主要病害,为建立烟草抗TMV分子标记辅助选择体系,本研究以高抗TMV烤烟品种Coker176和易感TMV烤烟品种Y3以及它们的BC1F1群体为试材,采用分离集团分组分析法（Bulked Segregation Analysis,BSA）和简单序列重复（Simple Sequence Repeat,SSR）标记技术,筛选与TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记。通过对18764对SSR引物的分析表明,有396对SSR引物在两亲本间有多态,选出1对SSR引物TM508-007扩增出的标记与TMV抗性的N基因紧密连锁,遗传连锁距离为0.41 cM,证实获得的与TMV抗性基因N紧密连锁的共显性SSR标记稳定可靠,可用于烟草抗TMV分子标记辅助选择。      

叶片衰老诱导FLP重组酶删除转基因烟草外源基因的研究

  目的   “Gene-deletor”系统可实现转基因植物中外源基因的清除。为了研究该系统在转基因烟草中对清除外源基因的作用并最终创制不含外源基因的烟草新种质。  方法   以含有“Gene-deletor”系统的转基因烟株为材料,分析外源筛合报告选融基因Bar::GUS、重组酶基因FLP在不同叶龄叶片中的表达水平,同时通过观察转基因烟草花粉中GUS蛋白的表达活性,分析外源基因GUS在花粉中的删除情况。  结果   （1）相同叶龄不同转基因烟株叶片均表现出GUS活性和对除草剂草铵膦抗性,且3个转基因烟草株系中GUS活性和对除草剂抗性都表现出随着叶龄增大而降低的特点。（2）Real-time PCR和RT-PCR结果进一步证明外源Bar::GUS基因表达水平随叶片发育成熟持续下降,而外源FLP基因的表达水平则出现先增后降的变化趋势,在测定后期两者的表达量均达到最低,（3）花粉GUS组织染色结果表明,“明,色结果降的变化趋势,特系统诱导各转基因植株中花粉外源基因清除效率不同,平均清除率分别78.3%,54.7%和75.2%。  结论   在转基因烟草中,叶片衰老特异表达基因SAG12基因启动子驱动“动启动子驱动达基因,平均清系统（LoxP/FRT）的表达不仅可引起转基因植株叶片中外源基因的特异性清除,还能诱导花粉中外源基因的删除,该技术可为进一步创制培育不含外源基因的烟草新种质提供参考。      

转复制酶基因抗病毒烟草的研究

将携带烟草花叶病毒(TMV)54KD蛋白基因和黄瓜花叶病毒(CMV)3'端缺失0.9kb的复制酶基因片段的植物表达载体pBICT,通过很痛农杆菌311SE系,利用叶圆盘法转化烟草,在含有卡那霉素的选择培养基上诱导生芽、生根,得再生植株53株。移入大田后,选取5株,提取植物总DNA,Southern杂交检测,结果5株中均有复制酶基因的整合,且转基因植株在大田中表现了良好的抗TMV和CMV能力。      

干旱胁迫对转BnDREB1-5烟草碳氮代谢和渗透调节物质的影响

在干旱胁迫后检测了转BnDREB1-5基因烟草碳氮代谢指标和渗透调节物质的变化。结果表明,干旱胁迫后转基因烟草碳代谢指标淀粉酶活性、转化酶活性和可溶性糖含量都明显升高,野生型烟草淀粉酶活性和可溶性糖含量稍微升高,转化酶活性反而降低;转基因烟草氮代谢指标硝酸还原酶活性、可溶性蛋白质含量稍微下降,而野生型烟草两者都明显降低;转基因烟叶中有BADH活性,干旱胁迫后BADH活性升高,而野生型烟草中检测不到BADH活性;干旱胁迫后转基因烟叶中脯氨酸含量是野生型的1.08倍。因此,干旱胁迫后转基因烟草碳氮代谢、防御酶活性等方面明显优于野生型。     

海藻糖增强烟草对普通花叶病的抗性及其机理的初步分析

[目的]明确海藻糖能否增强烟草对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）病的抗性。[方法]采用半叶枯斑法、组织化学染色法、qPCR等技术分析海藻糖对TMV钝化、预防和抑制的效果，海藻糖处理后烟叶中活性氧的含量和渗透调节物质的含量、抗氧化酶活性变化，相关抗氧化和抗病基因的表达变化。[结果]海藻糖能够钝化TMV，对花叶病有治疗和预防的效果。海藻糖处理24 h后，烟叶中H₂O₂和脯氨酸含量升高，POD和SOD活性下降，APX和编码NADPH氧化酶亚基基因的表达水平升高，抗病基因PR、N-LIKE基因和NtEIG-48表达增加。海藻糖处理未影响烟株的正常生长。[结论]认为海藻糖可能通过提高叶片中的H₂O₂含量，激活抗病基因表达而增强烟草对TMV的抗病性。      

硅对镉胁迫下烟草光合作用的影响

为研究硅对镉胁迫下烟草光合作用的影响,以云烟87为试验材料,以CdCl_2·2.5H_2O为镉源,K_2SiO_3为硅源,用KNO_3和HNO_3消除因添加K_2Si O_3而带来营养液pH和K+升高的影响,设置5个处理的水培试验:对照(CK)、0.05 mmol·L~(-1)Cd~(2+)(Cd_(0.05))、0.10 mmol·L~(-1)Cd~(2+)(Cd_(0.10))、0.05 mmol·L~(-1)Cd~(2+)+1.00 mmol·L~(-1)SiO_2(Cd_(0.05)+Si)、0.10 mmol·L~(-1)Cd~(2+)+1.00 mmol·L~(-1)SiO_2(Cd_(0.10)+Si)。结果表明,Cd_(0.05)和Cd0.10处理能明显降低烟株的高度,减少烟株的叶面积和生物量,净光合作用速率分别较CK下降52.02%和73.75%,差异极显著。硅可缓解镉胁迫对烟草的毒害作用,与Cd_(0.05)和Cd_(0.10)处理比较,Cd_(0.05)+Si和Cd_(0.10)+Si处理的气孔导度分别升高259.90%和13.29%,叶绿素含量分别增加43.47%和92.33%,净光合速率分别提高99.90%和72.78%。施硅能提高镉胁迫下烟草的表观量子效率和羧化效率。相关分析表明,烟草净光合作用速率与叶绿体中的镉含量存在显著负相关,而施硅能降低烟草叶绿体中的镉含量,这是硅提高镉胁迫下烟草光合作用的重要原因之一。     

打顶前后烤烟叶片蛋白质表达差异的研究

为研究打顶前后烤烟叶片蛋白质表达的差异,利用蛋白质双向电泳分离的方法对烟草打顶前和打顶后10天两个时期的叶片蛋白质表达进行了研究。经过对蛋白质表达图谱的分析和质谱鉴定,分析出9个在两个时期差异表达的蛋白质。在打顶后叶片中高表达的蛋白质有4个,其中3个与光合作用中光反应相关的蛋白,分别是叶绿体放氧复合蛋白,Atfkbp13和PsbP家族蛋白;另外1个打顶后显著表达增加的蛋白是β-1,3-葡聚糖酶前体蛋白,该蛋白与植物发育调控和抗病性有密切关系。在打顶后表达量降低的蛋白共鉴定出5个,其中SHM1,SHM2和乙醇酸氧化酶为与光呼吸相关的蛋白,而叶绿体核糖体蛋白L1和60S核糖体蛋白与植物生长发育和细胞分裂相关。这些差异表达的蛋白表明,打顶可以通过在蛋白水平促进烟草叶片的光合作用和叶片抗性途径相关蛋白的表达,而增强叶片的光合作用和叶片的抗性,同时对与光呼吸能量代谢相关的蛋白表达则有所抑制,从而减弱叶片的能量代谢以调节叶片的生长。     

不同浓度硒对烟草根系形态、生长素含量及相关基因表达的影响

为明确施用不同质量浓度硒对烟草根系形态、生长素含量及生长素相关基因表达量的影响,在人工培养箱中(光强300μmol·m~(-2)·s~(-1),28℃/16 h昼,24℃/8 h夜)以DR5::GUS云烟87转基因烟草(纯合株系)为供试材料进行烟苗培育,并测定了不同浓度硒处理(培养基硒浓度0、1、5、10和20 mg/L)的烟草根系生物量、根长、侧根数、MDA含量(质量分数)、生长素含量(质量分数)、生长素合成限速酶NtYUCCA编码基因以及生长素极性运输蛋白NtPINs基因家族表达量。结果表明:硒对烟草的生长发育具有双重效应。低浓度硒(1 mg/L)处理条件下,生长素合成NtYUCCA基因家族与生长素极性运输蛋白NtPINs基因家族的表达水平提高,GUS活性增强,根系生长素含量增加,烟草生物量显著提高,根系构型发生改变(主根伸长,侧根数量多),MDA含量降低,抗氧化能力增强,进而促进了烟草的生长发育;高浓度硒(10mg/L)处理条件下,生长素含量降低,GUS活性减弱,烟草的生长发育受到抑制。     

过表达三七PnSS基因对烟草萜类物质含量及生长发育的影响

为明确PnSS基因在调节烟草萜类物质含量中的作用,构建了PnSS基因过表达载体,并通过叶盘法转化烟草品种巴斯玛14号,获得了PnSS基因过表达烟草植株,最后利用HS-SPME-GC/MS分析转化烟草叶片中的香味物质含量（质量分数）。结果表明：(1)PnSS的氨基酸序列与其在烟草中同源物NtSS具有81.9%的一致性,并含有角鲨烯和植烯合成酶结构域。(2)PnSS基因的过表达导致烟草植株变矮、叶片变小;与根和茎相比,叶片中PnSS基因表达量最高。(3)PnSS基因的过表达使烟叶中乙酸、糠醇、4,6-二甲基嘧啶、苯乙醛、3,5-二甲基苯甲醛、二烯烟碱、二氢猕猴桃内酯、2-甲基吡嗪、壬酸、异戊醛、2-甲基丁醛、西松烯和烟碱13种香味物质含量增加,2,3-二氢-3,5二羟基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮、2,3-联吡啶、植醇、苯乙醇、新植二烯、苯甲醛和麦斯明7种香味物质含量降低。因此,过表达PnSS基因会抑制烟草植株的生长发育并改变烟叶中萜类物质等香味物质的含量。     

打顶期烟草组织基因表达分析及打顶对腋芽基因表达的影响

打顶是烟叶生产重要的技术环节之一。为了研究烟草(Nicotiana tabacum)打顶期基因表达模式,选取广西大宁地区晒黄烟现蕾期10个打顶或非打顶的组织样本,构建链特异总RNA测序文库,利用Illumina HiSeq 2000完成测序。通过质量控制,获得9千多万条测序数据,分析获得50 706个基因的表达信息。筛选组织特异和打顶差异表达基因,共富集687个组织特异表达基因和444个腋芽打顶差异表达基因,为烟草组织基因表达模式和打顶分子响应机制研究提供数据支撑,也为调控烟草营养和生殖生长提供分子靶标。     

打顶及仿生型信号分子对白肋烟不同烟碱转化率株系的影响

为降低白肋烟烟碱转化率、提高烟叶品质,对白肋烟B37不同转化率株系采用打顶和打顶后涂抹仿生型信号分子(BSM)两种方式处理,分别测定了不同处理烟株烟叶的超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、生物碱含量,并分析了生物碱比例和烟碱转化率的变化.结果表明:打顶使不同转化率株系的烟叶SOD活性增加且高转化率株系增加幅度大,BSM处理也增加了SOD活性,但高转化率株系增加幅度较小.打顶使烟株的MDA含量增加,但高转化率株系增加幅度较小;BSM处理后烟叶MDA含量下降,高转化率株系烟叶MDA含量下降幅度较大.BSM处理后烟叶4种生物碱含量及总生物碱含量总体上有所降低,其中降烟碱的降低幅度最大.BSM对非转化株上部叶和中部叶烟碱比例影响较小,而对高转化株系B37-38的作用最大,其上部叶和中部叶烟碱比例分别提高了15.52和10.40百分点;B37-38上部叶和中部叶降烟碱比例分别降低了15.16和10.03百分点.从非转化株系至高转化株系随着烟碱转化率的提高,BSM处理其降烟碱的比例降低幅度增加,BSM对高转化率株系的影响较大.