陕西烟草青枯病的病原鉴定

2013年7月在陕西省西乡县韩岭村烟田首次发现疑似烟草青枯病病株,为了解陕西烟草青枯病的发生危害,对陕西省不同烟区的烟草青枯病的发生情况进行全面系统调查,并对田间采集的具有典型青枯病病症的烟草茎部样本进行了病原鉴定。结果表明:陕西省烟草青枯病发生区域为陕南的汉中、安康和商洛的三个种烟区,在延安、宝鸡和咸阳的三个烟区尚未发现,发病于6月上旬,盛发于7月中旬。该病害随温度升高而病情加剧,发病早期田块死苗严重,发病率可高达24.67%,而且有蔓延扩展趋势;通过对烟草茎秆上分离的病原细菌进行形态观察、致病性测定、生理生化性状等常规细菌鉴定技术,结合细菌16S rDNA序列分析,鉴定该病原菌为青枯劳尔氏菌Ralatonia solanacearum。      

豫南烟区烟草青枯病菌的致病力及遗传多样性分析

为有效防控豫南烟区烟草青枯病,对来自信阳市罗山县、驻马店市确山县和遂平县的烟草青枯病菌的致病力和遗传多样性进行了测定分析。人工接种试验表明,豫南烟区烟草青枯病菌的致病力分为强、中和弱3种,不同寄主来源的烟草青枯病菌具有显著的致病力差异。从100个随机引物中筛选出8个扩增条带清晰且具有丰富多态性的引物用于不同地区烟草青枯病菌菌株DNA的RAPD分析,共扩增出720条带,其中多态性带占88.9%。聚类结果和遗传相似系数分析显示,供试菌株可分为A、B两大类,遗传相似系数范围为0.49~1.00,且供试菌株间的遗传相似性与其地理来源有一定的相关性。综上所述,豫南烟区烟草青枯病菌的致病力存在明显差异且其DNA具有丰富的遗传多样性。     

湖北恩施地区烟草青枯菌的生理分化研究

本研究对湖北恩施烟区青枯病菌（Ralstonia solanacearum）的生理小种、生化型和演化型进行了鉴定,为湖北省烟草青枯病抗性品种的选育和利用提供了理论依据。从湖北恩施地区的8个县（市）采集青枯病感病烟株,通过平板稀释分离和特性性引物检测从中分离鉴定到54个具有致病性的烟草青枯菌菌株。采用注茎接种法将供试菌株分别接种青枯菌6个鉴别寄主,确定所有的菌株均属于生理小种1;基于青枯菌对3种双糖和3种己醇利用能力的检测结果,将54个菌株鉴定为生化型Ⅲ;经青枯菌演化型PCR检测,54个菌株均能扩增得到片段大小分别为280 bp和144 bp的两条特异性条带,这说明全部分离菌株均属于青枯菌演化型Ⅰ型。     

烟草青枯病拮抗菌的筛选、鉴定和防病潜力评价

为进一步丰富烟草青枯病的生防资源,通过平板稀释法,对贵州省黔南州4个烟区的健康烟株及根际土壤进行烟草内生细菌及根际细菌的分离纯化,共得到烟草内生细菌103株,根际细菌73株。利用抑菌圈法,筛选出抗青枯病菌的内生细菌LSN02和根际细菌LLGJ04,其抑菌圈直径分别为29.96和38.65 mm。进化分析结果表明,LSN02和LLGJ04均属于芽孢杆菌属且具有趋化性。盆栽试验中,LSN02和LLGJ04可有效增强烟株对青枯病的抗病能力。用中浓度(1×10~8cfu/mL)和高浓度(2×10~8cfu/mL)的LSN02菌株处理烟株时,烟草青枯病的病株率显著降低。     

皖南烟田三种土传病原物分子检测

为检测皖南烟田土传病害的分布,2011-2012年从皖南烟区烟田共采集土样51份,采用分子生物学方法对烟田土壤进行了烟草黑胫病、根黑腐病和青枯病检测。结果显示,烟田土壤中烟草黑胫病菌、根黑腐病菌和青枯病菌的阳性率分别为19.6%、41.2%和56.9%,3种烟草土传病原菌在皖南烟区多数烟田均有分布,其中青枯病菌检出率最高。本研究证明了应用分子生物学方法检测土传病原菌的可能性,生产上可为烟草种植提供理论依据。     

我国主要烟草青枯病病圃青枯菌系统发育分析

为探究我国主要植烟区烟草青枯病鉴定病圃中青枯菌的系统发育,采用演化型分类框架下的序列变种分类方法,对从各烟株和土壤样品中分离得到的100株青枯菌进行系统发育分析。结果表明,所有菌株可归为4个分支,分别为序列变种15、17、34、54。其中,云南文山州广南县病圃中的菌株为序列变种17和54,福建泰宁县的菌株为序列变种34,福建三明市三元区的菌株为序列变种15和34,广东白云区的菌株为序列变种15和17,广东南雄市的菌株为序列变种15、17和34,安徽宣城市宣州区的菌株为序列变种34和54,贵州福泉的菌株为序列变种17,重庆彭水的菌株为序列变种17。本研究发现同一病圃中存在多个序列变种,某些病圃同一地块中烟株与土壤分离所得菌株序列变种不一致。     

湖北恩施烟区烟草青枯菌致病力分析

为有效进行恩施烟区烟草青枯病的防控,本研究采用人工接种的方法鉴定了恩施烟区烟草青枯菌的致病性。根据红花大金元、K326和岩烟97三个烟草品种病害流行下曲线面积(AUDPC)数值进行聚类分析,将恩施地区烟草青枯菌划分为强、中、弱3种致病型,表明恩施烟草青枯菌是一个由弱到强连续变化的群体。3种致病型菌株在恩施南部和北部区域均有分布,其中恩施北部区域菌株致病力稍高于南部。     

重庆烟区青枯雷尔氏菌生化变种及序列变种的特性研究

为进一步明确重庆烟区烟草青枯菌的遗传及生化特性,采用生化变种分类标准及演化型复合PCR、系统发育进化分析对重庆10个烟草青枯病发生区县青枯雷尔氏菌的种下分化情况进行了研究。结果表明:46株烟草青枯雷尔氏菌均属于生化变种3和亚洲分支菌株(演化型Ⅰ)。内切葡聚糖酶基因(egl)和DNA修复蛋白基因(mutS)部分序列的系统发育学分析表明:46株供试菌株可聚类到青枯雷尔氏菌演化型Ⅰ的3个序列变种,分别为序列变种15、17和44,其中序列变种17和44为优势菌株。表明重庆烟草青枯雷尔氏菌具有一定的遗传分化和地理区域特性。     

河南烟草镰刀菌的分子鉴定及致病性分析

为明确河南省不同烟叶产区危害烟草的镰刀菌种类,以河南省烟叶产区典型镰刀菌根腐病烟株及烟田土壤为供试样品,采用组织分离法和土壤分离法获得纯化菌株,根据菌株形态和rDNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定,并采用无创接种法测定病原菌对烟草的致病性。结果表明,获得的98个菌株在PDA培养基上均产生白色菌丝,大型分生孢子呈镰刀形或马特形,无色、多孢;小型分生孢子呈肾形、椭圆形或卵形,无色、多无分隔。序列比对结果显示,所分离的98株菌分属尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）、层出镰刀菌（Fusarium proliferatum）、木贼镰刀菌（Fusarium equiseti）和Fusarium nematophilum。致病性分析结果表明,尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌对烟苗具有致病性;48株致病菌中豫南烟区烟草镰刀菌根腐病致病性病原菌为尖孢镰刀菌、层出镰刀菌和木贼镰刀菌,以尖孢镰刀菌为主;豫中为尖孢镰刀菌;豫东、豫西为茄病镰刀菌和尖孢镰刀菌。因此,尖孢镰刀菌为全省烟区重点防控对象,豫南烟区还需加强层出镰刀菌和木贼镰刀菌的防控,豫东、豫西需防范茄病镰刀菌的发生。      

福建烟草青枯菌演化型及生化变种鉴定研究

本研究尝试采用国际上新兴的青枯菌演化型分类框架并结合传统的生化变种鉴定方法,旨在探究福建省烟草青枯病菌系的构成,从而揭示青枯病的流行规律,为指导烟草青枯病的抗病育种提供理论依据。2008~2009年,分别于福建省南平、三明以及龙岩地区田间烟草病株上分离获得了45个烟草青枯病菌株。经青枯菌演化型复合PCR检测,45个菌株均能够扩增得到片段大小分别为144 bp和280 bp的两条特异性扩增条带,从而表明全部分离菌株均系青枯菌演化型I型即亚洲分支菌株。继而基于45个分离菌株对3种双糖和3种己醇氧化利用能力的检测结果,鉴定出其中43个菌株属于青枯菌生化变种III,1个菌株属于生化变种IV,1个菌株属于非标准型生化变种（能利用山梨醇和甜醇,不能利用3种双糖和甘露醇）。该研究结果部分揭示了造成国外引进的烟草品种青枯病抗性水平下降或丧失的可能原因。      

广东烟草青枯病菌菌系研究

广东主要烟区南雄县和梅州市的烟草青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）没有本质上的差异。供试的菌株对烟草、茄子、番茄、辣椒都有强致病力,均为小种１,对２个花生品种（汕油７１,蔓生型）的致病力均分化为３个类型。所有菌株都能利用３糖３醇产酸,为生化型Ⅲ。琼脂双扩散试验结果表明,绝大部分菌株都能与南雄菌株和大埔菌株的抗血清形成３条吻合相连的沉淀带,说明这两个烟草青枯病菌菌株的亲缘关系十分密切。     

湖北地区烟草青枯菌系统发育分析

本研究采用青枯菌演化型分类框架,对来源于湖北烟区的48个烟草青枯菌进行系统发育学分析并进行序列变种鉴定,以明确该地区烟草青枯菌的菌系分化。基于青枯菌内切葡聚糖酶基因(egl)和DNA蛋白修复基因(mutS)的系统发育学分析结果表明,48个供试菌株属于青枯菌亚洲分支(演化型Ⅰ)的3个序列变种,分别为序列变种15、17和44,未发现我国已报道的烟草青枯菌序列变种34。其中序列变种17和44为优势菌系,且均来源于恩施地区;序列变种15只包含来源于十堰地区的3个菌株。本研究表明湖北地区烟草上的青枯菌存在一定程度的遗传分化。     

无致病力青枯菌株对烟草青枯病的控制作用

为进一步揭示无致病力菌株对烟草青枯病的控病机理,以无致病力青枯菌株为材料,针对烟草青枯病进行了温室控病及田间小区试验,并通过抗药性标记测定其抗药性突变菌株在烟株体内的定殖状况,同时分析处理后烟株体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性变化。结果显示:无致病力菌株Tbw1-7-3在温室盆栽条件下对青枯病的相对防效达89.4%,其田间防效在发病初期10~20 d与药剂农用链霉素处理间无明显差异,且其抗药性突变株在烟株根表和体内可短暂定殖。同时菌株Tbw1-7-3能提高寄主中PAL、POD和PPO 3种酶活性及促进病程相关蛋白(PRP)的积累。无致病力菌株对烟草青枯病具有较好的控制作用,以菌株Tbw1-7-3的防效最优。田间试验也显示Tbw1-7-3菌株在发病初期具有良好的控病效果。无致病力青枯菌株的控病机理可能兼有占位效应及诱导抗病性。      

两株防治烟草青枯病的烟草根际拮抗菌

  目的  进一步丰富烟草青枯病的生防资源。  方法  采用抑菌圈法和盆栽试验测定分离自烟草根际的细菌菌株GZYCT-4和GZYCT-9对青枯病菌的拮抗活性;运用PCR技术检测拮抗细菌的生防标记基因,利用趋化性试验研究烟草根系分泌物及其所含的各种有机酸对拮抗菌根部定殖的影响。  结果  （1）GZYCT-4和GZYCT-9对烟草青枯病菌均具有较好的抑菌效果,培养48 h的抑菌圈直径分别为16.64 mm和18.90 mm,盆栽试验表明灌根接种施用GZYCT-4和GZYCT-9可有效防治烟草青枯病。（2）GZYCT-4和GZYCT-9菌株均检测到8个枯草芽孢杆菌生防标记基因,其脂肽类粗提物对烟草青枯病菌的抑菌圈直径分别达到16.24 mm和20.71 mm。（3）GZYCT-4对红花大金元根系分泌物有较强的趋化反应,且红花大金元根系分泌物含有的草酸对GZYCT-4吸引作用较大,而GZYCT-9则对K326根系分泌物有较好的趋化反应,K326根系分泌物所含的柠檬酸对GZYCT-9有较好的吸引作用。  结论  GZYCT-4和GZYCT-9菌株均可有效地防控烟草青枯病,且对不同品种的烟草根系分泌物及其所含的各种有机酸有趋化差异。      

烟草青枯病病圃土壤微生物多样性初步分析

为了更好地利用烟草青枯菌拮抗菌防治烟草青枯病,采用微生物保守区域扩增、构建文库、生物信息比对的方法初步分析了烟草青枯病病圃土壤中微生物的多样性。结果显示,烟草青枯病病圃土壤微生物群落中含有伯克霍尔德氏菌(Burkholderia fungorum)、假单胞杆菌属类(Pseudomonas graminis)、黑霉菌(Aspergillus niger)、尖孢镰刀菌属(Fusarium oxysporum)等丰富的细菌类和真菌类微生物,也包括部分不可培养的微生物。土壤中微生物多样性的分析可以为青枯菌拮抗菌应用中拮抗菌在土壤中的定殖、扩繁过程研究提供部分微生物群落信息。     

生物炭对根际土壤微生态的调控及对烟草青枯病的防控作用

  目的  探究不同用量的生物炭对根际土壤微生态的调控及对烟草青枯病的防控作用  方法  采用稀释平板法,研究生物炭对青枯菌的吸附作用及对其生长和运动性的影响;盆栽试验研究生物炭对烟草生长及青枯病发病情况和土壤基本理化性质的影响;利用高通量测序技术,比较各处理土壤细菌群落差异。  结果  （1）生物炭对青枯菌具有抑制作用,可吸附青枯菌、抑制其生长及运动性,用量超过1.5%时效果显著;（2）生物炭提高了土壤pH、有机质、速效磷和速效钾含量,利于烟草的生长。相关性分析发现,生物炭对土壤pH和化学性质的改善,是抑制烟草青枯病发生的主要原因;（3）生物炭提高了根际土壤微生物群落的Alpha多样性和放线菌门中链霉菌属的相对丰度;（4）根际土壤细菌结构的多样性与土壤理化性质有一定的相关性,其中有效钾影响最大。  结论  生物炭通过对青枯菌的抑制作用和对土壤微生态的改善,创造了利于烟草生长的环境条件,减少了烟草青枯病的发生。