烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的克隆及组织表达谱

为揭示牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPPS)小亚基在烟草(Nicotiana tabacum)中的生理功能,采用电子克隆的方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术,从烟草中克隆到1个牛儿基牛儿基焦磷酸合成酶小亚基基因的cDNA序列,命名为NtGGPPS5(GenBank登陆号:KF316932)。该基因全长1320 bp,编码332个氨基酸,与番茄(Solanum lycopersicum,XP_004246572)及其野生种(Solanum pennellii,ADZ24721)的GGPPS小亚基的氨基酸序列一致性均为92%,具有一个特征性的异戊二烯合成酶保守的天门冬氨酸富集区。进化分析表明,植物GGPPS分为大亚基和小亚基两个分支,而且NtGGPPS5属于小亚基。实时荧光定量PCR试验表明,NtGGPPS5基因在烟草根、茎、叶和芽中均有表达,表达量为芽叶茎根。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因的克隆及分析

采用RACE技术,从烟叶中克隆了一个新的编码GGPPS蛋白的基因,命名为Ntggpps3,并对其进行了生物信息学分析。Ntggpps3的cDNA序列为1251 bp,包含一个长度为1092 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。NtGGPPS3蛋白与其他植物GGPPSs高度保守。生物信息学预测结果表明,NtGGPPS3的分子量为39.5 kD,等电点为6.28,为亲水性蛋白,N端有叶绿体信号肽。二级结构主要由螺旋和无规则卷曲组成,三级结构含有两个富含天冬氨酸的区域,并通过同源建模构建了NtGGPPS3的3D模型。进化分析表明,植物的GGPPS分为大亚基和小亚基两个分支,而且NtGGPPS3属于大亚基。     

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因家族的全基因组鉴定

为了揭示烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)基因家族的特征和功能,利用生物信息学方法对烟草GGPPS家族进行了全基因组查找、鉴定及相关分析。在普通烟草中共鉴定出9个成员(大亚基7个、小亚基2个),林烟草、绒毛状烟草中分别鉴定出5个成员(大亚基4个、小亚基1个)。GGPPS的开放阅读框长度为999~1 119 bp,编码332~372个氨基酸,蛋白质分子量为36.2~40.7 kD,等电点为5.41~8.32。大亚基和小亚基基因分别含有1个和2个外显子;大亚基与小亚基均具有DD(XX)_1-2D和CXXXC保守性基序,但存在一定的差异。在进化过程中,烟草GGPPS家族可能发生了串联重复复制和片断复制;普通烟草GGPPS家族可能发生了基因丢失,NtabGGPPS1-1和NtabGGPPS1-2较其他成员进化速率快,同时可能受到了净化选择。      

烟草类胡萝卜素异构酶基因的克隆及功能研究

为了进一步研究烟草类胡萝卜素异构酶（Carotenoid isomerase,CRTISO）基因的功能,从普通烟草（Nicotiana tabacum）的cDNA中成功克隆出CRTISO基因编码区（CDS）全长,长度为1716 bp,Blast结果显示与马铃薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）的前番茄红素异构酶（Prolycopene isomerase）基因的相似度达93%。将CRTISO基因的部分序列插入烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）载体中,构建重组载体pTRV2-CRTISO。通过TRV病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing,VIGS）系统抑制本氏烟草（Nicotiana benthamiana）CRTISO基因的表达,同时利用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测CRTISO下游基因的表达量变化。结果表明,与对照组相比,TRV-CRTISO载体侵染的烟草叶片出现黄色斑点;CRTISO基因的沉默导致下游番茄红素ε环化酶（ε-LCY）、番茄红素β环化酶（β-LCY）和胡萝卜素β-环羟化酶（β-OHase）基因表达量降低。对烟草CRTISO基因功能的研究有助于揭示烟草中类胡萝卜素合成代谢途径的调节机制,为选育优质烟草品种奠定理论基础。      

烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的克隆和功能分析

为进一步明确烟草牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因NtGGPPS1的功能,根据已公布的普通烟草(Nicotiana tabacum)GGPPS1基因编码区序列设计特异性引物,从普通烟草K326中克隆到NtGGPPS1基因。构建荧光表达载体PFF19-Nt GGPPS1-GFP,对NtGGPPS1基因进行亚细胞定位研究。通过荧光定量PCR分析了普通烟草K326在不同激素处理下NtGGPPS1基因的表达量变化。构建NtGGPPS1基因的RNAi载体pHellsgate2-Nt GGPPS1,通过农杆菌浸染烟草K326后获得NtGGPPS1基因显著下调的烟株,检测了烟株中质体色素含量的变化情况。结果表明:Nt GGPPS1融合蛋白基因的绿色荧光分布在烟草BY-2细胞的质体上,表明该基因定位于质体。用茉莉酸甲酯(MeJA)处理烟草后,NtGGPPS1基因的表达量显著升高,而用生长素(IAA)处理后,该基因的表达量下降。与对照相比,在NtGGPPS1基因下调的烟株中其质体色素含量均显著降低,预示NtGGPPS1参与了烟草β-胡萝卜素的生物合成。     

烟草法呢基焦磷酸合酶基因的克隆及序列分析

采用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,以烟草品种K326叶片总RNA为模板扩增出烟草法呢基焦磷酸合酶基因fps,克隆至载体PMD19-T中。序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长702 bp,共编码234个氨基酸残基,其核酸序列与玉米、杜仲、拟南芥、青蒿、Nicotiana sanderae×Nicotiana langa-dorffii杂交种的法呢基焦磷酸合酶基因的核酸序列同源性分别为74%,76%,77%,80%和97%。     

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)基因的功能,采用同源克隆的方法从普通烟草(Nicotiana tabacum)中克隆了NtZDS基因,并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析NtZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达,在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析NtZDS上下游基因的表达量变化,并检测了烟株色素含量的变化。结果显示:NtZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝,其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较,该基因沉默后,烟株新生叶片出现严重白化现象,能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因;同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低,表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。      

病毒诱导的基因沉默防控烟草马铃薯Y病毒病研究

  背景  病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）是植物抗病毒侵染的一种自然机制。  方法  以马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）脉坏死株系（PVYN）的外壳蛋白（coat protein, CP）基因为靶向序列,构建烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus,TRV）介导的基因沉默表达载体pTRV2-CP,转化农杆菌GV3101后,与pTRV1-GV3101混合成TRV: : CP（OD₆₀₀ 0.4~0.6）喷施处理剪叶后的烟苗,测定其侵染效率。人工接种PVY于对照及TRV: : CP处理的烟苗,RT-qPCR检测、表型观察和小区试验评价TRV介导的VIGS体系对PVY侵染的沉默效果。  结果  ① 与TRV: : 00相比,接种PVY 35 d时,TRV: : CP处理的烟株中PVY累积量减少了72.8%;②VIGS表达载体45 d内能有效表达;③温室盆栽和田间小区试验TRV: : CP处理对PVY防治效果分别达到85.12%和73.08%。  结论  研究建立的VIGS体系能够沉默PVY CP基因的表达,有效防治烟草马铃薯Y病毒病,为PVY的防治提供了新的方法。      

受PVY诱导的烟草NtERD1的基因分离与表达分析

通过抑制差减杂交和cDNA芯片法从受PVY诱导的烟草抑制差减杂交文库中筛选得到一段长为745 bp的基因EST片段,经Blast同源性比对分析,该序列与植物脱水诱导早期应答基因(ERD)在核苷酸和氨基酸水平上高度同源。ORfinder分析表明,该序列包含一个492 bp的开放读码框,编码163个氨基酸。氨基酸Blastp比对显示,该氨基酸序列与其他植物脱水诱导早期应答蛋白具有很高的同源性。所以筛选得到的这个新基因属于烟草脱水诱导早期应答基因,被命名为NtERD1(GenBank登录号为GU144573)。实时荧光定量PCR分析表明,NtERD1在PVY接种早期上调表达,因此NtERD1受PVY侵染诱导,可能对烟草抗病毒具有重要作用。     

烟草NtGCN2启动子的克隆及功能研究

[目的]探究烟草蛋白激酶NtGCN2启动子驱动GUS基因在ABA、SA、AZA和MeJA四种处理下的表达模式.[方法]克隆烟草NtGCN2上游2000bp的启动子序列,并采用Plant CARE和PLACE数据库进行顺式作用元件预测.构建NtGCN2启动子驱动β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的融合表达载体并转化烟草K32...     

烟草硝酸盐转运蛋白NtNRT1.5基因的克隆及功能分析

【背景和目的】低亲和硝酸盐转运蛋白NRT1家族基因在植物吸收和转运硝态氮过程中发挥重要作用,为研究烟草NRT1家族基因在烟草氮素利用中的作用。【方法】从栽培烟草品种K326中克隆获得NtNRT1.5的全长cDNA序列,利用生物信息分析、qRT-PCR技术和转基因技术系统分析NtNRT1.5基因的序列特征、表达模式及在提高烟草氮素利用效率方面的功能。【结果】NtNRT1.5全长序列包含1800bp开放阅读框、编码599个氨基酸,编码的蛋白质具有NRT基因家族的共有结构特征,与拟南芥AtNRT1.5相似性达到59.28%。亚细胞定位结果表明NtNRT1.5蛋白定位在细胞膜上,其启动子中包含多个与硝酸盐（A(C/G)TCA）、胁迫（MYB）、根系特异表达（ROOT MOTIF BOX）相关的响应元件。表达模式分析结果表明NtNRT1.5主要在根部表达,其次是衰老叶片和茎,新叶基本不表达;低氮抑制其在根系中的表达,说明NtNRT1.5主要负责正常条件下的硝酸盐的吸收;低氮条件下,NtNRT1.5过表达显著提高了转基因烟株的氮素利用率。【结论】NtNRT1.5基因在烟草氮素的吸收和转运上行使重要...     

普通烟草NtNAC042基因克隆、鉴定及功能分析

  背景和目的  NAC转录因子是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、生物/非生物胁迫中发挥着十分重要的调控作用,在普通烟草中克隆NtNAC042基因。  方法  进行生物信息学分析、亚细胞定位、转录激活试验和表达模式分析,以及基因功能分析。  结果  （1）生物信息学分析表明,NtNAC042基因编码蛋白具有高度保守的NAC结构域;（2）亚细胞定位和转录激活试验结果表明,NtNAC042定位于细胞核中,具有转录激活活性;（3）表达模式分析表明,NtNAC042基因在根和衰老叶片中表达量较高且受干旱胁迫、盐胁迫、H₂O₂处理诱导;（4）NtNAC042过表达烟草植株抗盐性显著提高。  结论  NtNAC042作为NAC型转录因子,在烟草衰老落黄及生物和非生物逆境应答中发挥着重要的调控作用。      

普通烟草生长素抑制因子NtIAA17的克隆与功能分析

  背景和目的  盐胁迫会抑制作物的生长发育, 从而影响作物的产量和品质。生长素/吲哚-3-乙酸(Aux/IAA)蛋白是响应生长素信号的关键因子, 参与调控植物的生长发育和响应非生物胁迫。  方法  为了研究烟草生长素反应基因NtIAA17在烟草生长发育过程中的功能, 以烟草K326为试验材料, 通过克隆获得烟草NtIAA17基因, 利用生物信息学分析其序列特征, qRTPCR技术分析NtIAA17在烟草不同组织及盐胁迫处理0~12 h的表达模式, 利用转基因技术获得过表达NtIAA17-OX(NtIAA17-overexpression)转基因烟草, 对其进行响应盐胁迫的功能鉴定。  结果  NtIAA17基因片段为624 bp, 编码207个氨基酸; 相对分子质量为23.07 kD, 理论等电点为8.24, 该基因启动子区含有顺式作用元件与激素及胁迫相关; 具有Aux/IAA家族蛋白的四个结构域(I-IV)和保守序列。NtIAA17基因与菠菜生长素抑制基因MoIAA13亲缘关系最近; 亚细胞定位分析表明, NtIAA17蛋白是核定位蛋白。qRT-PCR结果表明, NtIAA17基因在茎和老叶中高表达, 盐胁迫2 h时表达量最高。在盐胁迫条件下, NtIAA17-OX转基因烟草与野生型相比, 生物量显著增加, 脯氨酸含量积累增加, 而MDA含量减少, 抗氧化酶基因NtSOD、NtPOD表达量增加。  结论  NtIAA17基因可以响应盐胁迫信号, 通过提高转基因烟草的抗氧化性来抵御盐胁迫带来的伤害, 增加植株的生物量; 本研究为后续耐盐胁迫分子育种提供候选基因和理论依据。      

普通烟草SWEET基因家族的鉴定与表达分析

  目的  为挖掘参与烟草糖代谢的SWEET（sugar will eventually be exported transported）基因家族成员。  方法  以拟南芥SWEET蛋白为参考,利用生物信息学方法,对栽培烟草的SWEET蛋白家族进行鉴定,分析蛋白理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构和顺式作用元件,对其在不同组织和不同胁迫处理的表达模式进行检测。  结果  从普通烟草中鉴定到70个可能的SWEET基因,系统发育树将其划分为4个亚家族,大多数烟草SWEET基因在进化过程中经历纯化选择。不同烟草组织的表达模式分析显示,一些烟草SWEET基因具有组织表达特异性。不同胁迫处理的表达模式分析显示,部分烟草SWEET基因在葡萄糖、蔗糖、低温、干旱或者是盐胁迫处理下表达量变化明显。  结论  Ntab0097340和Ntab0727890是烟草植株重要的响应干旱与低温胁迫的基因,本研究为深入研究烟草SWEET基因功能提供有价值的参考信息。      

普通烟草GATA转录因子家族鉴定及基因表达分析

GATA转录因子在调控植物的生长发育和逆境胁迫应答等过程中具有重要作用。为了明确烟草中GATA基因的结构与功能,基于同源搜索和结构域鉴定的方法从普通烟草基因组中鉴定出57个GATA基因家族成员,分别命名为NtGATA1~NtGATA57。基因结构、保守结构域和系统进化的生物信息学分析表明:烟草GATA基因家族成员可分为4个亚族,且同一亚族成员核心结构域氨基酸序列组成非常保守,各基因成员的外显子数目在1~17之间。转录组数据分析表明:大多数NtGATA基因在烟叶衰老的不同时期均有表达,而且不同家族成员的表达模式存在差异;实时荧光定量PCR分析发现:10个NtGATA基因对冷、盐和干旱等非生物胁迫存在不同程度的响应。说明烟草GATA基因家族成员在烟叶成熟衰老及逆境响应过程中可能发挥了重要作用。      

烟草脱落酸受体基因NtPYR1和NtPYL9的克隆及表达模式分析

为揭示烟草脱落酸(ABA)受体基因NtPYR1和NtPYL9的生物学功能,以拟南芥PYR1和PYL9基因为探针,在NCBI中通过同源比对查找普通烟草表达序列标签(Expressed sequence tag,EST)序列,将EST序列进行拼接并设计特异性引物,从普通烟草红花大金元c DNA文库中克隆出NtPYR1和NtPYL9基因,其开放阅读框长分别为678 bp和564 bp,分别编码225个和187个氨基酸。NtPYR1和NtPYL9蛋白都具有一个保守的疏水性结构域,同属于PYR/PYL/RCAR ABA受体基因家族,NtPYR1和NtPYL9与番茄同源蛋白的相似性分别达到79.10%和95.24%。遗传聚类分析结果显示:NtPYR1和NtPYL9与番茄和马铃薯同源基因的遗传进化距离最近,说明PYR1和PYL9在茄科植物中较为保守。定量PCR对烟草不同组织表达模式分析表明,NtPYR1和NtPYL9在烟草不同组织中均有表达,分别在子叶和须根中的表达量最高。NtPYR1和NtPYL9表达均受ABA抑制,同时受H₂O₂诱导,说明两基因可能参与烟草的抗逆生理过程。      

6个烟草重要产量相关性状的遗传分析

  目的  探索和分析烟草重要产量相关性状的遗传规律,为深入研究其遗传机制及烟草新品种选育过程中重要产量相关性状的选择提供依据。  方法  以烤烟Y3（P₁）和K326（P₂）为亲本配制杂交组合,在2年2点4个环境条件下利用主基因+多基因混合遗传模型方法对该组合各单世代（P₁、P₂、F₇和F₈）的株高、叶数、节距、茎围、腰叶长和腰叶宽进行遗传及相关分析。  结果  （1）在4个环境条件下,株高分别与叶数、节距间呈极显著正相关,腰叶长与腰叶宽两者间也呈极显著正相关,而节距与叶数间则呈现极显著负相关,且上述性状间的平均相关系数范围为-0.687~0.832。（2）最优遗传模型对于株高、叶数和节距3个性状均符合2对加性-上位性主基因+加性-上位性多基因混合遗传模型（MX2-AI-AI）,其主基因遗传率分别为94.304%、95.632%和91.532%,多基因遗传率分别为3.965%、0和5.489%;腰叶长和腰叶宽2性状均是受2对抑制作用主基因+加性多基因（MX2-IE-A）控制,其主基因遗传率分别为88.383%和90.166%,多基因遗传率分别为7.348%和8.807%;茎围则由3对加性-上位性主基因（3MG-AI）控制,其主基因遗传率为72.051%。  结论  上述性状在多个环境条件下主要受主基因+多基因混合遗传模型控制（除茎围外）,主基因遗传率远大于多基因遗传率,受环境影响较小,且以主基因遗传为主。故此,在烟草育种过程中针对产量相关性状的定向选择宜在早期世代进行。      

烟草祖先种及重要野生种PDR1基因的生物信息学分析

植物的多向耐药性（Pleiotropic drug resistance, PDR）转运蛋白隶属于ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运蛋白家族的G亚家族。该类蛋白参与植物多种初生、次生代谢物的跨膜运输,在植物的生长发育、响应逆境胁迫、解毒过程中起着重要作用。近年的研究还表明,该蛋白与多种植物对真菌病原的抗性有关。本文以烟草祖先种和重要野生种为研究对象,以拟南芥PDR12蛋白、烟草的PDR1基因为探针,通过搜索同源序列,从数据库中提取烟草及祖先种、重要野生种中的PDR基因、蛋白序列,并通过生物信息学分析手段对其编码蛋白的理化特性、氨基酸序列特征、蛋白结构、功能、启动子序列及表达调控特征进行了分析,并以本氏烟（Nicotiana benthamiana）NbPDR1为代表,预测了该基因启动子的顺式作用元件,以普通烟草（Nicotiana tabacum）NtPDR1基因为例,预测了其基因编辑位点。结果表明,这些PDR基因相似性高,均编码跨膜蛋白,具有典型的跨膜结构域和核酸结合结构域。该基因启动子区有多个与病原真菌诱导、干旱等逆境胁迫响应相关的元件,暗示该基因可能是抗真菌病害、响应逆境胁迫的广谱抗性基因。最后,本文预测的基因编辑位点,为烟草PDR基因的功能研究、基因编辑及抗病育种提供理论基础。      

烟草硝酸还原酶基因NIA1启动子互作蛋白的筛选

硝酸还原酶是植物氮同化过程中的关键酶和限速酶。为更好地调控硝酸还原酶基因的表达,本实验克隆了烟草硝酸还原酶基因NIA1上游938bp的启动子区域,构建了烟草cDNA基因表达文库,应用酵母单杂交技术筛选NIA1启动子序列互作蛋白。通过序列测定和生物信息学分析,共筛选出9个互作蛋白cDNA。其中,功能不明确的预测蛋白7个,具有明确功能信息的蛋白2个,分别为含有CRM结构域的CFM3蛋白（No.71）,和烟草亚硫酸盐氧化酶类似蛋白Sulfite oxidase-like蛋白（No.126）。这些蛋白均为NIA1启动子序列互作蛋白,可能作为转录因子参与NIA1基因的转录调控过程。