重组大肠杆菌的包涵体

包涵体（Inclusionbody）是指细菌表达的蛋白质在胞内互相凝集而形成的无活性固体颗粒。由于其在相差显微镜下为黑色斑点，所以也称为折射体（Refractilebody）[1]。它基本上由蛋白质组成，这些蛋白质一级结构是正确的，但立体构型是错误的。本文所指的包涵体是转化载有目的基因质粒的工程细胞，在某些因素的诱导下，目的基因高度表达，在胞内所形成的难溶性颗粒。运用基因工程技术使许多生物活性蛋白质的基因在异体细胞中获高效表达[2]。人们在用大肠杆菌表达人胰岛素时，发现在对数后期，用扫描电镜观察，工程菌壁上有显著凸起，放大数倍…     

Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用

大肠杆菌基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠杆菌基因敲除中的应用已经越来越成熟。综述了几种不同的Red同源重组技术,并分析了每种方法的原理及操作策略,指出了各种方法的特点及优势。     

高压匀浆破碎释放重组大肠杆菌提取包含体过程的研究

用高压匀浆机对重组大肠杆菌细胞进行破碎以释放重组人白细胞介素－6(rhIL-6)包含体,系统研究了高压匀浆过程中物理和化学因素的影响,包括匀浆次数,操作压力,料液的pH及悬浮体系的影响。从而选择操作压力为800MPa。悬浮体系为去离子水,经3次破碎,表达量为20％的 菌体可获得粗包含体的纯度约40%。此外,本文还对该高压匀浆破碎过程进行了动力学分析。     

基因重组10BNP在大肠杆菌中的表达与纯化

在摇瓶中对基因重组脑钠素（BNP）在大肠杆菌中的表达进行了研究，确定诱导后最佳培养时间为4h，表达量达21．8％，采用金属螯合亲和层析法对十聚体脑钠素进行了纯化，比较了咪唑洗脱法和降pH值洗脱法对目标蛋白的纯化效果，得到了一条纯化目标蛋白最佳亲和层析纯化路线，为后续实验打下了很好的基础。     

Ralstonia eutropha PHB－4重组菌合成PHA共聚物及性质测定

A series of polyhydroxyalkanoate（PHA）copolymers consisting of short-chain-length（SCL）and medium-chain-length（MCL）3-hydroxyalkanoate（3HA）monomers were synthesized in the recombinant Ralstonia eutropha PHB - 4 harboring a low-substrate-specificity PHA synthase PhaC2Ps from Pseudomonas stutzeri 1317. These polyesters,whose monomer compositions varied widely in chain length,were purified and characterized by acetone fractionation,nuclear magnetic resonance（NMR）,gel-permeation chromatography（GPC）,and differential scanning calorimetry（DSC）.This was the first time that the physical properties of PHA copolymers polymerized by PhaC2Ps were characterized.The results indicated that the variation in MCL 3HA contents did not have an obvious influence on the molecular weights of these PHA copolymers but was effective in changing their physical properties. The variation in the thermal property of PHA copolymers with 3-hydroxyoctanoate（3HO） content was also investigated in this study.     

重组大肠杆菌DH5α发酵培养基的优化

为了提高重组大肠杆菌DH5α生产rNGR—Tum-5,研究了培养基中不同种类的碳氮源物质和微量元素对工程菌生产蛋白能力的影响。得出在培养基组分（％）为：甘油1,酵母粉3,蛋白胨1,氯化钠0．5,微量元素母液150u时,重组大肠杆菌DH5仅生产rNGR-Tum-5最强,较初始培养基提高了5倍。     

诱导条件对重组大肠杆菌发酵中人白细胞介素6表达量的影响

对重组人白细胞介素6 (rhIL-6)大肠杆菌摇瓶发酵工艺作了研究.探讨了诱导策略对菌体生长和rhIL-6表达量的影响.结果表明,含有温敏扩增型质粒pKpL3a的重组hIL-6大肠杆菌,在2×YT培养基中发酵,接种量为0.2%,于30℃,180 r/min摇瓶中培养,当菌密度OD 600约为1.5时,转至42℃或40℃诱导,维持时间至少为1 h,然后转至37℃培养3 h,最终rhIL-6表达量可达32%.于40℃或42℃下诱导时间低于1 h,则使最终rhIL-6表达量降低 .如果采用42℃或40℃恒温诱导,rhIL-6表达量仅为20%.     

重组大肠杆菌分批-补料高密度发酵生产类人胶原蛋白的动力学

The kinetics of batch and fed-batch cultures of recombinant Escherichia coli producing human-like collagen was investigated. In the batch culture, a kinetic model of a simple growth-association system was concluded without consideration of cell endogeneous metabolism. The cell lag time, the maximum specific growth rate and Yx/s were determined as 1.75h, 0.65h^-1 and 0.51g·g^-1, respectively. In the fed-batch culture, different specific growth rates were set at （0.15, 0.2, 0.25h^-1） by the method of pseudo-exponential feeding, and the expressions for the specific rate of substrate consumption, the growth kinetics and the product formation kinetics of each phase were obtained. The result shows that the concentrations of cell and product can reach 77.5g·L^-1 and 10.2g·L^-1 respectively. The modal predictions are in good agreement with the experimental data.     

超声破碎重组大肠杆菌释放包含体的过程研究

重组人白细胞介素 (rhIL - 6 )基因表达产物在大肠杆菌的细胞浆中以包含体的形式存在。用超声破碎法提取rhIL - 6包含体系统研究了该过程中的物理和化学因素 ,包括破碎时间 ,输出功率 ,菌体浓度 ,缓冲液pH值 ,菌体冻融及悬浮液体系等。得到了破碎提取包含体的最适条件为 :超声功率 4 80W ,菌体浓度为 1 0 0g L左右。在去离子水中经过 1 5min超声破碎 ,表达量为 2 0 %的菌体可获得包含体的含量为 4 0 %(质量分数 ,下同 )     

Recovery of Human Interferon Alpha-2b from Recombinant Escherichia coli by Aqueous Two-Phase System

Recovery of periplasmic human recombinant interferon alpha-2b (IFN-α2b) from Escherichia coli rosetta-gami2 (DE3) using a single-step polyethylene glycol (PEG)-potassium phosphate aqueous two-phase system (ATPS) was investigated in this study. The influences of system parameters including PEG molecular weight, tie-line length, volume ratio, crude stock loading, system pH, and sodium chloride (NaCl) concentration (%, w/w) were studied. The results showed that the optimum condition to obtain the high purification factor of IFN-α2b in a single step was achieved by ATPS composed of 4% (w/w) PEG 8000, 13% (w/w) potassium phosphate, 0.5% (w/w) NaCl, 10% (w/w) crude stock, and a system pH of 6.5. A purification factor of 26.3 and recovery yield of 40.7% were obtained from optimized ATPS.     

分泌型重组人生长激素工程菌的高密度发酵

目的　研究葡萄糖剂补加策略 ,以获得大肠杆菌的高密度发酵和人生长激素 (HGH)的高表达。方法　采用批式发酵和补料批式发酵方式 ,葡萄糖的补加采用逐渐增加的方式 ,包括pH、DO和浓度控制。结果　获得HGH的表达量为 30 0mg/L ,光密度达到 12 4(A60 0 )。结论　在大肠杆菌中表达异源蛋白时 ,葡萄糖的补加方式是关键因素 ,补料批式发酵要优于批式发酵     

重组Echistatin融合基因工程菌高密度发酵工艺优化

目的优化大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合基因工程菌的发酵工艺。方法在15L发酵罐内,研究培养基、培养条件和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,并考察工程菌中重组质粒的遗传稳定性。结果工程菌在pH7·4的2×YT培养基中诱导4h,菌体湿重可达75g/L,目的蛋白表达量约占总蛋白的35%,所构建的重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。结论优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和表达条件,为规模化生产奠定了基础。     

化学法和机械法从大肠杆菌释放人肿瘤坏死因子

对化学法和机械法破碎基因工程大肠杆菌以释放人肿瘤坏死因子的影响因素作了考察。在化学法破菌中研究了破碎时间、试剂浓度、溶剂ｐＨ值、加入表面活性剂等因素的影响。在机械法破碎中研究了停留时间、装珠量、搅拌转速、细胞浓度等的影响，对操作条件进行了优化。通过对二者的比较，发现机械法破碎细胞效率高，但产生细小的碎片不利后分离；化学法释放产物有选择性，但操作时间长。     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

稀释复性法体外复性重组牛凝血酶原-2包涵体

对重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性进行了研究。凝血酶原-2是α-凝血酶生成过程中的一个最小的单链中间前体。重组牛凝血酶原-2在E.coli中高效表达并形成包涵体,经2.5mol?L?1脲和0.7%Triton X-100洗涤,再用8mol?L?1脲和0.3mol?L?1DTT溶解后,得到了包涵体裂解液。研究优化了体外复性溶液,其组成为含2.7mol?L?1脲、0.6mmol?L?1GSSG、GSSG/GSH0.9、0.1%PEG6000和0.5mol?L?1L-Arg、pH7.4Na3PO4缓冲液。牛凝血酶原-2复性后经透析,再被Echis Carinatus Snake Venom激活,转化为有活性的α-凝血酶,其总活力可达2948U?mL?1。结果表明稀释复性法可用于重组牛凝血酶原-2包涵体的体外重折叠复性。     

基因工程菌株BLG8900的遗传稳定性

目的研究基因工程菌株BLG8900的遗传稳定性。方法在有选择压力(加氨苄西林)的条件下,测定pYC2质粒在大肠杆菌BLG8900株[含有质粒pYC2的BL21(DE3)]中的遗传稳定性。结果工程菌连续传10、25、50和100代后质粒具有良好的稳定性,而且经BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切,酶切图谱相同。第100代菌株重组质粒的GnRH/TRS序列与原代菌株相同。原代与第10、25、50和100代菌株经IPTG诱导表达,GST-GnRH/TRS融合蛋白表达水平、菌体蛋白的SDS-PAGE图谱鉴定无明显差异。Western blot表明各代菌株表达产物均具有GnRH抗原特异性。结论质粒pYC2在大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中有较好的遗传稳定性。     

重组大肠杆菌全细胞催化合成S-苷甲硫氨酸

从大肠杆菌(E.ColiK12)基因组DNA中克隆出甲硫氨酸腺苷转移酶基因,构建了能高效表达甲硫氨酸腺苷转移酶的重组大肠杆菌E.ColiJM109(pBR322-MAT)。将重组大肠杆菌细胞用于催化合成S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的研究中。实验发现,用φ(甲苯)=2%的水溶液对重组细胞进行通透化处理后,能大幅提高SAM的产率。探讨了底物浓度、温度、pH、反应时间以及菌体密度对反应转化率的影响。最佳反应条件为:底物浓度(ATP)30 mmol/L,反应温度35℃,pH=7.0,反应时间8 h,细胞密度80 g湿细胞/L反应液。在此条件下,底物ATP的转化率超过95%。     

重组降血压肽在大肠杆菌中的高效表达

目的获得具有高活性的重组降血压多肽。方法人工合成高活性降血压肽单体,经酶切位点串联,克隆至表达载体,并转化宿主菌BL21进行诱导表达。结果经酶切、PCR和测序均证明,串联的基因ACEIP已成功克隆至pGEX-4T-2表达载体中,融合蛋白GST-ACEIP的表达水平达24·6%,表达产物的融合蛋白和多肽含量分别为1·1g/L和0·14g/L,其抑制活性达85%。结论已成功制备出高活性的重组降血压多肽,为进一步开发降血压药物奠定基础。