TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法的建立及验证

目的 建立TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法，并进行验证。方法 采用正交试验确定捕获抗体、检测抗体最佳浓度，建立TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法，并对方法进行线性范围、特异性、检测限、定量限、准确性、重复性验证；采用建立的方法检测多种生物制品，验证方法的适用性。结果 选定捕获抗体用3μg/mL浓度包板，检测抗体稀释15 000倍建立TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法。该方法线性范围为0.41～40.00 ng/mL，检测限为0.258 ng/mL，定量限为0.5 ng/mL；检测标准品、样品时，测量偏差小于5%；重复性验证CV<5%；不同类型样品加标回收率在80%～120%之间。结论 建立的TrypLE双抗体夹心定量ELISA检测方法特异性、准确性、重复性良好，可准确、有效、快捷地检测各种类型生物制品中TrypLE的残留量。     

四价脑膜炎球菌多糖疫苗中结合物多糖抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的建立一种检测A、C、W135和Y群四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群多糖蛋白结合物的双抗体夹心定量ELISA检测方法,并进行验证。方法以白喉类毒素无毒变异体(CRM197)特异性单抗为包被抗体,HRP标记的脑膜炎球菌A、C、W135和Y群多糖特异性单抗为捕获抗体,建立可定量检测脑膜炎球菌各血清群结合物多糖含量的双抗体夹心ELISA法,确定方法的最佳线性范围和检测限,并对方法的特异性、准确性和重复性进行验证。结果定量检测A群脑膜炎球菌结合物(GAMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为3.75~120 ng/ml,检测限为3.75 ng/ml;定量检测C群脑膜炎球菌结合物(GCMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~30 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml;定量检测W135群脑膜炎球菌结合物(GWMPCRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为7.5~240 ng/ml,检测限为7.5 ng/ml;定量检测Y群脑膜炎球菌结合物(GYMP-CRM197)多糖抗原含量的双抗体夹心ELISA法的线性范围为1.875~60 ng/ml,检测限为0.938 ng/ml。A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法均能特异性地检测相应的结合物多糖抗原含量,而不与其他群的结合物多糖抗原发生交叉反应;A、C、W135、Y群双抗体夹心ELISA法的回收率均在80%~120%之间,检测相应的结合抗原样品时,变异系数(CV)均小于15%。结论建立的双抗体夹心ELISA法特异性较强,准确性较高,重复性良好,可用于四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群结合物多糖抗原的定量检测。     

检测重组人血小板生成素含量的改良双抗体夹心ELISA方法的建立

目的建立检测重组人血小板生成素(rhTPO)含量的改良双抗体夹心ELISA方法。方法用棋盘滴定法确定包被单抗、一抗和酶标二抗的最佳工作浓度;绘制标准曲线,确定线性范围、检测限和定量限;检测该方法的准确性(回收率)、精密性和特异性,并与Lowry法检测结果进行比较。结果包被单抗的最佳包被浓度为1.0μg/ml,一抗和酶标二抗的最佳使用浓度分别为1∶5000和1∶10000;检测的线性范围为(125～4000)pg/ml,检测限为75pg/ml,定量限为189pg/ml;不同浓度rhTPO的回收率在(97.0±2.1)%～(105.0±8.5)%之间;6批样品的试验内变异系数在3.2%～8.1%之间,试验间变异系数在5.7%～10.4%之间,特异性良好;与Lowry法检测结果具有良好的相关性。结论已建立检测rhTPO含量的改良双抗体夹心ELISA法,准确性、精密性、特异性良好,可用于rhTPO研究及生产过程中的定量分析。     

重组戊型肝炎p179疫苗小鼠抗体间接ELISA检测方法的建立及其初步应用

目的建立重组戊型肝炎p179疫苗抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。方法确定重组戊型肝炎疫苗p179抗原的最佳包被浓度及包被条件、酶标抗体的最佳稀释度、封闭条件、最佳抗体稀释液,对建立的方法的特异性、准确性及精密度进行验证,并与市售ELISA试剂盒进行比较。结果抗原最佳包被浓度为1μg/ml,4℃包被过夜;酶标抗体最佳稀释度为1∶5 000;3%牛血清白蛋白封闭3 h;最佳抗体稀释液为含1%酪蛋白PBS。建立的方法检测的A450与重组戊肝抗原浓度呈明显的剂量依赖性,对不相关的anti-HAV、anti-HB、anti-INF、anti-RABV无交叉反应;36份小鼠阳性血清的检出率为100%;3份阳性血清重复检测20次的CV均小于15%。市售某厂家ELISA试剂盒检测48份血清,阳性检出率为83.3%,建立的间接ELISA方法检测,阳性检出率为89.6%。结论建立了重组戊肝p179疫苗抗体间接ELISA检测方法,可用于重组戊肝疫苗小鼠免疫后血清抗体的检测。     

破伤风抗体体外结合ELISA检测方法的建立及初步验证

目的建立破伤风抗体体外结合ELISA检测方法,并进行初步验证。方法将破伤风疫苗免疫后获得的小鼠血清与破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)在体外进行结合,将结合后的血清转移至已包被的酶标板中,分别加入二抗、酶标抗体和底物等进行检测,建立破伤风抗体体外结合双抗夹心ELISA法。对建立的方法进行特异性、线性范围、检测限、重复性和准确性初步验证。结果建立的破伤风抗体体外结合双抗夹心ELISA法的标准曲线在浓度为0.016~1 U/ml之间时,可获得最佳线性,相关系数R=0.999 8;检测限为0.009 U/ml;与白喉-百日咳抗体无交叉反应;重复性验证中高浓度和低浓度质控血清的变异系数(CV)分别为4.467%和5.419%;准确性验证中高浓度和低浓度质控血清的相对偏差分别为-8.03%和-14%。结论建立的破伤风抗体体外结合ELISA检测方法具有良好的特异性、重复性和准确性,为破伤风疫苗效价检测新方法的建立奠定了基础。     

人血清中猪抗人淋巴免疫球蛋白双抗体夹心ELISA检测法的建立及验证

目的建立人血清中猪抗人淋巴免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte porcine immunoglobulin,ALG)双抗体夹心ELISA检测法,并进行验证。方法以兔抗猪Ig G包被酶标板,HRP酶标记的鼠抗猪Ig G为二抗,建立人血清中ALG含量的双抗体夹心ELISA检测法,并对方法中包被浓度及二抗浓度进行优化,同时验证该方法的重复性、敏感性、准确性、特异性及稳定性。采用优化后的方法对14位严重型再生障碍性贫血(severe aplastic anemia,SAA)患者进行ALG的血药浓度监测(therapeutic drug monitoring,TDM)。结果最佳包被浓度为1∶2 000,最佳二抗稀释度为1∶8 000。参考品浓度在4.9~5 000μg/ml范围内标准曲线的四参数Logistic曲线拟合较好,R2值为0.991 1,在4.9~156μg/ml范围内的线性拟合也较好,R2值为0.991 5,批内重复性CV值均10%;其检测底限为0.39μg/ml;浓度为500、50及5μg/ml参考品的回收率为91.2%~107.0%;该方法可特异性检测出注射ALG患者血清中ALG含量;包被好的ELISA板及二抗、底物于4及37℃条件下分别保存1~3周及1~3 d后检测结果均较稳定。经DAS 3.1.4软件分析,14名经ALG治疗的SAA患者血清中ALG的曲线下面积(AOC)为(7.3±5.1)mg/(L·d)(95%CI),半衰期(t1/2)为(20.65±38.67)d(95%CI)。结论该方法具有良好的重复性、准确度及稳定性,可用于ALG的TDM。     

牛血清IgG双抗体夹心ELISA定量检测方法的建立及应用

目的建立牛血清Ig G(bovine immunoglobulin G,BIg G)抗原的双抗体夹心ELISA定量检测方法。方法用BIg G-Fc免疫BALB/c小鼠,制备抗BIg G单抗,确定包被抗体及酶标抗体后,建立定量检测BIg G抗原的双抗体夹心ELISA方法,并验证该方法的准确度、精密度、稳定性、特异性,确定该方法的线性范围和定量限度。应用建立的方法检测不同厂家、不同批次牛血清及纯化EV71样品中BIg G抗原残留量。结果建立了以3E12D2为包被单抗(8.0μg/ml,100μl/孔),4A2G1B1-HRP为酶标抗体(1∶1 000稀释,100μl/孔)定量检测BIg G的双抗体夹心ELISA方法,该方法的线性范围为0.3~9.6 ng/ml,R~20.99,定量限度为0.3 ng/ml;回收率在94.1%~108.5%之间,同一实验者重复检测和不同实验者检测的变异系数均10%;37℃放置3和6 d的稳定性均90%;该试剂样品与BIg G可发生特异性反应,与其他动物源血清无交叉反应。9批牛血清中BIg G含量均存在差异;精纯样品较粗纯样品BSA和BIg G均明显去除,但BIg G占牛血清残留量(BSA+BIg G)的比例却明显上升。结论建立的BIg G抗原的双抗体夹心ELISA方法符合定量检测需要,可用于牛血清的质量质控及残留量检测。     

脑膜炎球菌W135群多糖含量和分子大小双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

目的建立检测A、C、Y、W135群脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis,Nm)多糖疫苗(Groups A,C,Y,W135 menig-nococcal polysaccharide vaccine,MPV4)中W135群多糖含量和分子大小的双抗体夹心ELISA法,并进行初步应用。方法以抗W135群Nm多克隆抗体作为包被抗体,建立双抗体夹心ELISA法,采用棋盘滴定法筛选包被抗体与酶标抗体的最佳工作浓度,对W135群Nm多糖进行特异性定量测定,并验证线性关系的重复性;对建立的ELISA法进行特异性、准确度、精密度及定量限的验证;采用建立的ELISA法检测10批W135群Nm多糖样品和10批无关流脑多糖样品,进行W135群Nm多糖的鉴别试验;采用建立的ELISA法测定MPV4多糖含量、多糖分子大小和回收率。结果经棋盘滴定法确定双抗体夹心ELISA法的最佳包被抗体工作浓度为10μg/ml,最佳酶标抗体工作浓度为1∶15 000稀释,W135群Nm多糖在2.5~20 ng/ml浓度范围内剂量反应曲线线性关系良好,相关系数大于0.99。采用建立的双抗体夹心ELISA法检测W135群Nm多糖为强阳性,检测其余样品的结果均为阴性;试验内及试验间测定16、8、4 ng/ml W135群Nm多糖含量的变异系数在1.1%~9.0%之间,回收率在87.5%~105.0%之间,定量限为4 ng/ml;检测W135群Nm多糖的阳性符合率和无关多糖的阴性符合率均为100%。采用该法测定3批MPV4中W135群多糖含量、分子大小及回收率均符合申报MPV4疫苗暂行规程关于W135群Nm多糖的质量标准。结论建立的双抗体夹心ELISA法可用于MPV4中W135群多糖含量和分子大小的测定。     

人血清中抗鼠抗体间接ELISA检测方法的建立及临床应用

目的建立检测人血清中抗鼠抗体(HAMA)的间接ELISA法,并进行临床标本检测。方法采用间接ELISA法,选择最佳实验条件,确定阴阳性血清判定的界值,并进行方法学验证;用该方法检测WuTacⅠ期临床观察的健康志愿者血清抗鼠抗体。结果间接ELISA的最佳试验条件为:抗原包被浓度0.313μg/ml,血清稀释度1∶160,酶标抗体稀释度1∶80 000;阴阳性血清界值为0.210;该方法检测HAMA阳性标本的试验内和试验间变异系数分别为7.46%和5.48%,检测HAMA阴性标本的试验内和试验间变异系数分别为8.03%和14.7%;与马、山羊、兔、猴等动物血清无交叉反应;健康志愿者HAMA约在用药后10～14 d产生。结论已成功建立了检测人血清中抗鼠抗体的间接ELISA法,符合我国生物药品临床试验检测的要求。     

百日咳毒素兔多克隆抗体的制备及其ELISA定量检测方法的建立和验证

目的 制备百日咳毒素（pertussis toxin,PT）兔多克隆抗体（简称多抗）,建立定量检测PT抗原含量的双抗体夹心ELISA法,并进行验证及应用。方法 采用传统方法,用PT免疫青紫蓝兔制备PT兔多抗。优化ELISA系统反应条件,建立PT双抗体夹心ELISA定量检测方法,并进行特异性、线性、准确性、精密性、灵敏度验证。采用建立的方法对脱毒过程样品及其他百日咳抗原纯化过程样品菌毛蛋白（fimbriae proteins,FIM）原液中PT抗原含量进行检测。结果 PT抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的工作条件为PT兔多抗包被浓度为1μg/mL,酶标抗体稀释度为1∶8 000。此检测系统能与PT纯化蛋白发生特异性反应,而与百日咳丝状血凝素、白喉类毒素、破伤风类毒素均未发生交叉反应;建立的双抗体夹心ELISA法线性检测范围在25～400 ng/mL之间;PT高、中、低浓度回收率分别为103.27%、91.48%、103.52%;酶标板内和板间的变异系数（CV）均小于10%;该方法的灵敏度为20.719 ng/mL,检测下限为41.438 ng/mL。检测5种不同脱毒工艺条件下、不同取...     

人中性粒细胞载脂蛋白快速定量ELISA检测方法的建立

目的建立人中性粒细胞载脂蛋白(HNL)快速定量ELISA检测方法,并进行验证及初步应用。方法以兔抗人HNL多克隆抗体为包被抗体,HRP标记的HNL单克隆抗体为检测抗体,采用双抗体夹心模式,建立快速、一步定量检测HNL的ELISA方法,并进行验证及初步应用。结果最佳包被抗体工作浓度为1μg/ml,检测抗体的最佳稀释度为1∶1000,标准品浓度在0.1～10μg/L范围内呈良好的线性关系,相关系数r>0.98。经验证,该方法的灵敏度可达0.103μg/L;检测7.2、3.6和0.9μg/L浓度的HNL标准品,试验内变异系数分别为5.6%、6.8%和9.8%,试验间变异系数分别为5.7%、6.9%和10.5%;不同浓度的平均回收率为102.04%;抑制试验表明特异性较强;健全性分析表明,样品稀释倍数对该方法无影响;8d连续检测表明稳定性良好。用建立的方法检测30份健康成人血清的HNL含量为(90.73±30.12)μg/L。结论已建立了HNL快速定量ELISA检测方法,该方法简便、快速、稳定,适合临床常规检测。     

人β-hCG化学发光免疫分析方法的建立

目的建立一种检测人血清hCG浓度的双抗体夹心化学发光免疫分析方法。方法采用2种高特异性的抗β-hCG单克隆抗体,以一种包被微孔板制成固相抗体,另一种标记碱性磷酸酶,以金刚烷衍生物为底物,采用双抗体夹心法检测人血清hCG浓度,并与进口试剂进行比较。结果以5μg/ml单克隆抗体包被微孔板,酶结合物以1∶10000稀释,在室温条件下检测,可测范围为5~540mIU/ml,灵敏度为0.143mIU/ml,批内、批间平均变异系数分别为5.28%和7.05%,平均回收率为98.77%,范围为92.3%~108.6%,与TSH、FSH和LH的交叉反应率均小于0.01%。与国外同类试剂有良好的相关性。结论该方法有较高的灵敏度、精密性和准确性。     

EV71抗原ELISA定量检测方法的建立

目的建立EV71抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于EV71灭活疫苗生产过程中抗原含量的检测。方法采用EV71全病毒免疫,制备抗EV71单克隆抗体及多克隆抗体,以抗EV71多克隆抗体作为包被抗体,经HRP标记的抗EV71单克隆抗体作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,检测样品中EV71抗原含量,并对该方法进行验证及应用。结果所建立的方法线性范围为5～80U/ml,R2=0.994,线性关系良好,定量限度为5U/ml;检测不同浓度的EV71抗原内部参考品,回收率为88%～119.0%;变异系数均小于15%;与甲肝病毒收获液、乙脑病毒灭活液、H5N1流感病毒裂解疫苗原液、小牛血清、人白蛋白、Vero细胞、MEM培养基及CoxA16收获液均无交叉反应;检测EV71灭活疫苗原液纯化过程样品的抗原含量,能有效反映抗原纯化趋势;检测铝吸附疫苗成品解离后抗原含量,准确性较高。结论已建立了EV71抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法线性好,特异性强,灵敏度高,准确性及重复性良好,可用于EV71疫苗生产过程中及终产品的抗原定量检测。     

酿酒酵母残留蛋白ELISA定量检测方法的建立

目的建立酿酒酵母残留蛋白(Host cell protein,HCP)ELISA定量检测方法,为重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)及相关生物制品的质量控制提供依据。方法制备酿酒酵母全细胞蛋白参考品,以其为抗原,免疫家兔,采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,SDS-PAGE分析纯度,免疫双向扩散法测定抗体效价,Western blot法分析抗体的特异性。以制备的抗酿酒酵母多克隆抗体作为包被抗体,HRP标记的抗酿酒酵母多克隆抗体作为检测抗体,建立酿酒酵母抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法;梯度稀释酿酒酵母蛋白抗原参考品,并绘制标准曲线,确定该方法的线性范围及检测限,并进行特异性、准确度、精密度及适用性验证。结果共制备3批酿酒酵母抗原蛋白,其平均含量分别为1.61、1.64和1.63 mg/ml;纯化的IgG抗体纯度为91.7%,抗体效价为1∶64,能与酿酒酵母蛋白多数条带结合;酿酒酵母蛋白抗原浓度在6.25～200 ng/ml的范围内,线性关系良好(R2>0.99),最低检测限为6.25 ng/ml;用建立的方法检测小牛血清、人血白蛋白、MEM培养基、Vero细胞上清蛋白、Vero细胞乙型脑炎疫苗及PHK细胞狂犬疫苗,均无交叉反应,特异性良好;检测不同浓度的抗原回收率为97.6%～107.00%,变异系数均<10%,最低定量检测限为25 ng/ml;检测3批酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗生产各工序中酿酒酵母蛋白的残留量,能有效反映杂蛋白去除率。结论成功建立了酿酒酵母HCP双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法特异性强,精密度及准确度良好,可用于生物制品中酿酒酵母HCP的检测。     

抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂的制备

目的制备检测抗狂犬病马血清效价的ELISA试剂。方法采用ELISA间接法。先用抗狂犬病病毒IgY包被酶标板,并确定其最适包被浓度;制备酶标二抗,并确定其最佳使用浓度。对试剂的灵敏度、特异性、精密性、稳定性及与小鼠中和试验结果的相关性进行考核。结果抗狂犬病病毒IgY和酶标二抗的最适浓度分别为10!g/ml和1∶1500,试剂灵敏度为0.072IU/ml,特异性良好,批间及试验间变异系数均小于11%,37℃放置3和5d检测样品结果与放置前差异无显著意义,与小鼠中和试验结果呈正相关。结论所制备的抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂盒,可用于抗狂犬病马血清效价的检测。     

牛布氏杆菌特异性抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

目的建立牛布氏杆菌特异性抗体间接ELISA检测方法,并进行初步应用。方法用大肠杆菌表达的牛布氏杆菌重组BP26蛋白作为检测抗原,用棋盘滴定法确定包被抗原和待检血清的最佳工作浓度,对各种反应条件进行优化,建立间接ELISA方法,并进行验证。采用建立的间接ELISA方法与传统的试管凝集试验同时检测116份血清样品,评价二者的符合率。结果间接ELISA的最佳反应条件为:抗原包被量5μg/孔;待检血清稀释倍数1∶200,作用时间60min;酶标二抗作用时间60min;封闭液为5%BSA,作用时间45min。S/P值≥0.363者判为阳性,S/P值≤0.291者判为阴性,介于两者之间判为可疑。该方法精密性良好,特异性较强,敏感性较高,与传统的试管凝集试验检测结果的符合率为93.3%。结论已成功建立了检测牛布氏杆菌特异性抗体的间接ELISA方法,为布氏杆菌病的流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法的建立

目的建立疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量检测方法。方法制备Vero细胞蛋白抗原参考品,免疫家兔,提纯抗体作为包被抗体并以酶标记,建立酶联免疫检测系统。用Vero细胞蛋白抗原参考品绘制定量标准曲线,并对各项指标进行验证。结果提纯后抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶64,Westernblot分析显示,提纯抗体与Vero细胞蛋白抗原参考品中绝大部分蛋白成分均能特异性结合。确定最佳抗体包被浓度为10μg/ml,酶标抗体的工作浓度为1∶1000。Vero细胞蛋白抗原参考品定量范围为12.5～800.0ng/ml时,线性关系良好,r=0.997,该方法特异性、精密度及准确度良好。将试剂于4、25和37℃分别放置3周,检测同一定量参考品和样品中Vero细胞蛋白抗原含量,差异无显著意义。结论已建立了用ELISA检测疫苗制品中Vero细胞残余蛋白含量的方法。