人Bik基因的克隆、表达与纯化

目的克隆人Bik基因,并进行表达及纯化。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增Bik基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物进行GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到483bp的DNA片段,重组质粒pGEX-6p-1-Bik经酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的重组蛋白占菌体总蛋白的38%,纯化后蛋白纯度达96%。结论已成功克隆并利用原核表达系统表达了人Bik基因,为进一步研究Bik蛋白结构和功能奠定了基础。     

重组人白细胞介素-10的表达与纯化

目的表达并纯化重组人白细胞介素-10蛋白,并进行活性检测。方法将重组质粒PCRT7/NT-TOPO-IL-10转化大肠杆菌BL21(DE3)pLyse细胞,IPTG诱导表达。采用Ni柱对表达产物进行亲和纯化,并检测其对外周血单核细胞分泌TNF-α的影响。结果IPTG诱导4h,目的蛋白表达量最高,可达45.02%,主要以包涵体形式表达。纯化后,所得目的产物的回收率为66.72%,纯度约为80.42%。纯化的IL-10对外周血单核细胞分泌TNF-α具有抑制作用。结论已成功表达并纯化了重组IL-10蛋白。     

重组人白细胞介素1β的纯化及单抗制备

利用NaCl梯度洗脱DEAE-Sepharose cL-6B柱层析纯化重组人白细胞介素1β(rhlL-1β)。rhlL-1β成分在100mmol/L NaCl浓度处被洗脱,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为一条带,分子量约17.5KD。以此产品作为抗原,可制备出具有良好特异性的抗IL-1β单克隆抗体。     

人CD271基因的克隆及原核表达

目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。     

人Ⅰ型精氨酸酶基因的克隆及其酵母表达

用RT-PCR扩增人Ⅰ型精氨酸酶基因(hAⅠ),经DNA序列分析后,插入含α分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组表达质粒pPIC9K-hAⅠ.转化酵母宿主菌SMD1168,菌落PCR鉴定目的基因的整合,甲醇诱导工程酵母表达,用酶活检测的方式鉴定目的基因的表达,结果显示,经诱导的工程酵母胞内精氨酸酶活性为对照的2.3倍.     

重组人Stathmin基因的克隆及表达

目的克隆人Stathmin基因,并利用原核细胞进行表达。方法用PCR方法从Hela细胞cDNA文库中扩增Stathmin基因,PCR产物经TA克隆并测序后,克隆至pGEX-4T-1载体,并转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Westernblot鉴定。结果PCR扩增得到460bp的cDNA片段,经测序分析,与GenBank数据库报道的人Stathmin(NM_203401)序列一致,经SDS-PAGE和Westernblot证实诱导表达的蛋白为GST融合蛋白。结论利用原核表达系统表达了人Stathmin,为进一步研究Stathmin结构和功能奠定了基础。     

重组人溶菌酶的分离纯化及鉴定

目的建立重组人溶菌酶(human lysozyme,h LYZ)的分离纯化方法,并对纯化产物进行鉴定。方法采用固液分离、膜过滤、疏水层析及离子交换层析对hLYZ进行分离纯化;SDS-PAGE及HPLC法检测hLYZ纯度;按《中国药典》二部(2015版)蛋清溶菌酶效价检查法检测其效价;Western blot法检测其特异性;基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定其相对分子质量。结果该分离方法可获得单一组分的重组hLYZ;SDS-PAGE检测纯度达99%,HPLC分析纯度达98. 8%;纯化后的hLYZ可与抗人LYZ抗体特异性结合,活性为1. 2×105 U/mg,相对分子质量为14 697。结论建立的分离纯化方法易操作,成本低,得到的hLYZ纯度大于98%,该分离方法可用于hLYZ的规模化生产。     

人Ⅰ型精氨酸酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

PCR扩增人Ⅰ型精氨酸酶基因(hAⅠ),插入大肠杆菌表达载体pET30a中,构建重组表达质粒pET30a-hAⅠ,转化大肠杆菌宿主菌BL21(DE3),构建大肠杆菌基因工程菌BL21(DE3)(pET30a-hAⅠ),IPTG诱导后表达,菌体酶活为每克湿菌体34.6 U.SDS-PAGE分析表明,诱导后的BL21(DE3)(pET30a- hAⅠ)在约35 kD处有明显的蛋白表达.     

重组人白细胞介素-31表达条件的优化

目的优化重组人白细胞介素-31(rhIL-31)的表达条件。方法以不同浓度IPTG、不同诱导时间、不同诱导温度对含有pET32a/rhIL-31的工程菌E.coliBL21(DE3)进行诱导表达,用SDS-PAGE对表达产物进行分析。结果诱导时间为5h,IPTG浓度为1.5mmol/L,诱导温度为37℃时,rhIL-31的表达量最高。结论已初步优化了重组蛋白rhIL-31的表达条件。     

重组人表皮生长因子的分离和纯化工艺的研究

探讨了人表皮生长因子的分离思路并据此研究了人表皮生长因子的分离工艺,特别是对工程发酵液理化特征和各层析单元操作的结果进行了详细地研究分析.结果表明发酵液中目标产物与杂蛋白质间的分子量相差较大,其等电点也有一定的差距.在层析分离单元中,凝胶层析可使人表皮生长因子的纯度提高至94%以上,收率达72%以上;而离子交换层析与扩张床吸附则具有较高生产力的特点.根据不同的层析操作所提出的三条生产工艺而生产的人表皮生长因子可满足不同的市场需求.     

人甲状旁腺素N-端34肽基因的合成、克隆和融合表达

目的构建重组人甲状旁腺素N-端34(PTH34)肽的大肠杆菌融合表达菌株,并对其表达产物进行检测。方法选用大肠杆菌偏爱密码子,设计优化的人甲状旁腺素N-端34肽基因序列,通过6个DNA片段分段合成、片段连接、PCR扩增,经TA克隆到pMD18载体中,经测序验证,构建GST融合表达载体。结果经SDS-PAGE检测PTH(1-34)肽与GST蛋白的融合表达,经Westernblot分析具有免疫活性,通过GST亲和层析和Xa因子酶切,利用小分子蛋白电泳可检测到PTH(1-34)肽。结论已获得了能表达GST-PTH(1-34)融合蛋白的菌株。表达产物具有免疫活性,且能被Xa因子消化得到PTH(1-34)肽。     

重组人乳铁蛋白基因克隆及表达

目的　构建重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株 ,并对表达产物进行评价。方法　由外周血白细胞总RNA经RT- PCR克隆获得HLF基因结构cDNA ,测序后克隆入酵母表达载体获得质粒pPIC9K- HLF ,线性化后电转化入毕赤酵母 ,经G4 -18 YPD筛选多拷贝后进行甲醇诱导表达。结果　获得基因与GenBank中的人HLF0 1基因基本相符。 2株多拷贝菌株诱导表达产物均能与人HLF抗体反应 ,具有抑制大肠杆菌生长的作用。结论　获得了能分泌有活性HLF的重组人乳铁蛋白 (HLF)的毕赤酵母分泌表达菌株。     

人BimS蛋白的原核表达及纯化

目的克隆人BimS基因,原核表达并纯化目的蛋白。方法用PCR方法从HeLa细胞cDNA文库中扩增人BimS基因,克隆至pGEX-6P-1表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经GST亲和层析纯化。结果PCR扩增得到327bp的DNA片段,重组表达质粒pGEX-6P-1-BimS经双酶切鉴定和测序分析,表明构建正确。表达的目的蛋白相对分子质量约37000,表达量约占菌体总蛋白的30%,纯化后纯度可达93%。结论已成功克隆并原核表达了人BimS基因,得到纯度较高的BimS蛋白,为进一步研究其结构和功能奠定了基础。     

人血管生成抑制素基因的克隆、表达及纯化

目的 构建携带人血管生成抑制素基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的血管生成抑制素。方法 用PCR法从人纤溶酶原cDNA中扩增出Kringle 1-3基因,克隆入pET21a(+)载体中,在大肠杆菌BL 21中表达,表达产物经亲和层析纯化。结果 所构建的原核表达载体为高效表达系统,所表达的产物经层析纯化后可获得重组人血管生成抑制素。结论 可获得大量纯化人血管生成抑制素,为进一步临床应用奠定基础。     

小鼠白细胞介素-18的克隆及在原核细胞中的表达

目的克隆小鼠白细胞介素-18(mIL-18)全长cDNA,并使其在大肠杆菌中表达。方法利用RT-PCR和巢式-PCR,从活化小鼠腹腔巨噬细胞中扩增成熟IL-18的全长cDNA。经双酶切,将该cDNA片断插入表达载体pRSET-C,构建含T7启动子的原核表达载体pRSET-mIL-18。测序鉴定后,将重组体转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和/或乳糖的诱导下,使重组质粒获得表达。结果重组质粒读码框及mIL-18的序列与预期一致,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析获得证实。结论已成功构建了原核表达载体pRSET-mIL-18,并使其在大肠杆菌中获得了融合表达。     

人溶菌酶-木聚糖酶融合基因在毕赤酵母中的表达

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)-木聚糖酶(Xylanases,XynⅡ)融合基因。方法通过PCR技术将hLY基因与XynⅡ基因连接,中间插入肠激酶识别位点序列;将其克隆至载体pPIC9K上,构建重组表达质粒pPIC9K-XynⅡ-EKsite-hLY,经SacⅠ线性化后,电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选得到高拷贝转化子,PCR鉴定为阳性的克隆用甲醇进行诱导;表达的融合蛋白经Sephadex G-75凝胶柱层析纯化后,用肠激酶酶切,分别采用改良舒加法和DNS法测定hLY和XynⅡ的活性。结果获得的融合基因序列与理论序列完全一致;重组表达质粒构建正确;融合蛋白的hLY和XynⅡ活性分别为170和158 U/ml,经肠激酶酶切后,hLY的活性为520 U/ml,XynⅡ的活性达244 U/ml。结论已在毕赤酵母中成功表达了XynⅡ-EKsite-hLY融合基因,经肠激酶酶切后的目的蛋白活性均有较大提高。     

人血管生成素基因的克隆与表达

目的 为了获得人的血管生成素基因,并在原核表达系统中进行表达。方法 利用ＲＴ－ＰＣＲ技术 从人的肝脏组织中扩增出Ａｎｇ基因片段,并将其克隆到ｐＧＥＭ－Ｔ载体中进行序列分析,再亚克隆到原核表达到 ｐＥＴ２８ａ（＋）载体中。结果　构建了重组表达载体ｐＥＴＡ,转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）后,经ＩＰＩＧ诱导,Ａｎｇ基因蛋白在 ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达了相对分子质量约为１７０００的重组蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和薄层扫描分析表明,外源蛋白的表达量 占菌体蛋白总量的１０．６４％。结论 Ａｎｇ基因的克隆与表达为进一步研究其生物活性及应用奠定了基础。