去除百日咳毒素、丝状血凝素中内毒素的工艺探索

目的探讨无细胞百日咳疫苗纯化工艺中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)的内毒素去除问题。方法选用Triton法和离子交换层析法,分别对百日咳杆菌发酵液上清和经Capto SP Imp Res柱纯化的发酵液进行内毒素去除,按《中国药典》三部(2015版)相关方法检测纯化样品的蛋白含量、内毒素含量、抗原含量,并进行SDS-PAGE分析。结果使用Triton法和离子交换层析法均可以将FHA和PT这两种成分的内毒素在脱毒前阶段降低至200 EU/mg以下。在合适的纯化条件下使用离子层析去除内毒素的能力高于Triton法,而在对抗原的回收率上Triton法又稍占优势。结论使用Triton法和离子交换层析法均可解决FHA和PT去除内毒素的问题,两类工艺下对目的蛋白活性的影响有待进一步研究。     

百日咳毒素、丝状血凝素和黏附素的纯化

目的采用新型层析介质对无细胞百日咳疫苗百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、丝状血凝素(filamen-toushemagglutinin,FHA)和黏附素(pertactin,PRN)3组分进行分离纯化。方法调整PT和FHA发酵液上清的pH值和电导后,PT经Capto SP ImpRes和Capto MMC进行两步层析,FHA经Capto SP ImpRes进行一步层析;PRN热处理原液经Capto Adhere和Capto SP ImpRes进行两步层析。纯化产物经4%～12%NuPAGE进行鉴定,ImageQ分析纯度;LC-MASS(Thermo LTQ Velas)进行蛋白质的质谱检测;PT和FHA经BiaCore T200进行定量分析,并计算各步回收率。结果纯化后,无细胞百日咳疫苗3组分纯度均达95%以上;PT和FHA的总回收率均在30%左右;电泳图谱上的各组分条带经LC-MASS鉴定,均与Uniprot Bordetella pertussis数据库数据高度同源。结论采用新型层析介质有效纯化了无细胞百日咳疫苗PT、FHA和PRN,提高了抗原纯度,大大缩短了生产时间。     

无细胞百日咳疫苗抗原精制的新技术

<正>传统的无细胞百日咳疫苗生产工艺包括大发酵罐培养细菌、硫酸铵沉淀、解毒、高盐浓度抽取、透析和蔗糖梯度超离心等步骤。在生产过程中去除了百日咳菌体中的有毒成分,提取纯化出有效抗原,使无细胞百日咳疫苗在保持免疫原性的基础上大大减少了副反应的发生。在抗原的提取过程中,可以对不同抗原组分分别纯化后按一定比例混合,也可以对某些组分联合提取。     

百日咳毒素兔多克隆抗体的制备及其ELISA定量检测方法的建立和验证

目的 制备百日咳毒素（pertussis toxin,PT）兔多克隆抗体（简称多抗）,建立定量检测PT抗原含量的双抗体夹心ELISA法,并进行验证及应用。方法 采用传统方法,用PT免疫青紫蓝兔制备PT兔多抗。优化ELISA系统反应条件,建立PT双抗体夹心ELISA定量检测方法,并进行特异性、线性、准确性、精密性、灵敏度验证。采用建立的方法对脱毒过程样品及其他百日咳抗原纯化过程样品菌毛蛋白（fimbriae proteins,FIM）原液中PT抗原含量进行检测。结果 PT抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的工作条件为PT兔多抗包被浓度为1μg/mL,酶标抗体稀释度为1∶8 000。此检测系统能与PT纯化蛋白发生特异性反应,而与百日咳丝状血凝素、白喉类毒素、破伤风类毒素均未发生交叉反应;建立的双抗体夹心ELISA法线性检测范围在25～400 ng/mL之间;PT高、中、低浓度回收率分别为103.27%、91.48%、103.52%;酶标板内和板间的变异系数（CV）均小于10%;该方法的灵敏度为20.719 ng/mL,检测下限为41.438 ng/mL。检测5种不同脱毒工艺条件下、不同取...     

无毒性逆转的无细胞百日咳菌苗制备

将百日咳菌培养物上清液,经一段硫酸铵盐析提取百日咳主要保护性抗原 FHA 和 PT,用蔗糖密度梯度离心去除内毒素,以戊二醛解毒制成无细胞百日咳菌苗。该菌苗对家兔不产生热原反应,对小鼠毒性低,不引起明显的白细胞增多及组胺致敏活性,小鼠免疫后对百日咳毒菌脑腔攻击具有很好的保护作用,并可产生较高的抗体应答。菌苗经37℃保存3个月未出现毒性逆转现象,质量稳定,为大批量制造质量均一的无细胞百日咳菌苗提供了可能性。     

去除无细胞百日咳疫苗丝状血凝素纯化液中内毒素TritonX-114液相分离法的建立及其效果评价

目的 建立去除无细胞百日咳疫苗丝状血凝素（filamentous hemagglutinin,FHA）纯化液中内毒素的TritonX-114液相分离法,并评价其效果。方法 以影响TritonX-114液相分离法效果的TritonX-114加入量、4℃混匀时间、37℃分层时间、25℃16 743×g离心时间为试验因素,每个因素设计3个水平,通过正交试验设计12组试验。每组试验获得的样品均检测蛋白回收率,以蛋白回收率最高的条件为最佳。采用最佳条件去除3批无细胞百日咳疫苗FHA纯化液内毒素,检测FHA蛋白含量、内毒素含量及TritonX-114残留量。结果 TritonX-114液相分离法最佳条件：TritonX-114加入量为1%,4℃混匀时间为30 min,37℃分层时间为60 min,25℃167 43×g离心时间为10 min。最佳条件下去除3批无细胞百日咳疫苗FHA纯化液内毒素后,内毒素含量均<0.25 EU/mL,TritonX-114残留量均值为0.183%,蛋白回收率均值为91.04%。结论 TritonX-114液相分离法能够有效去除无细胞百日咳疫苗FHA纯化液中的内...     

无细胞百日咳疫苗中活性PT的保护作用

目的 比较经基因工程方法脱毒的无细胞百日咳疫苗(APV)中不同含量活性PT的保护作用。方法 用小鼠保护性试验(AMPT)评价不同含量活性PT疫苗样品的百日咳效力,组织胺致敏试验(HST)检测不同含量PT样品中PT活性。结果 含5ng活性PT的疫苗与不含PT的疫苗效力差异无显著意义;含50ng活性PT疫苗与不含和含5ng活性PT的疫苗效力差异有显著意义。用HST肛温测定法可以检测到含50ng活性PT的样品中PT活性。结论 AMPT适用于高度脱毒或基因工程脱毒的APV的效力检定,HST肛温测定法可以证实APV中PT的活性。     

无细胞百日咳疫苗纯化新工艺的建立

目的建立适合大规模生产的无细胞百日咳疫苗(Acellular pertussis vaccine,APV)纯化新工艺,使疫苗主要成分的比例稳定可控。方法复苏百日咳菌种并传代培养,在大罐发酵培养收获前,调整菌液的pH值至弱酸性,再通过离心获得上清液,经超滤浓缩和脱盐处理,使用阳离子交换层析进行目的组分的分离纯化,纯化产物经SDS-PAGE分离并经Western blot鉴定,确定最佳纯化条件。用建立的层析纯化新工艺连续纯化3批APV,检测各项指标,验证该工艺的重复性。结果收获前菌液pH值调至5.8～6.0,可使疫苗主要保护抗原在上清液中的含量明显提高;采用强阳离子交换层析的方法,从目的蛋白的捕获到多组分的分离提纯可一步完成,各目的蛋白组分的纯度均可达85%以上,回收率可达90%以上;建立的纯化新工艺具有良好的重复性。结论初步建立了可线性放大、适合APV大规模生产的层析纯化新工艺,为疫苗质量标准的提高奠定了基础。     

DE_(52)柱层析在无细胞百日咳菌苗制备中的应用

在无细胞百日咳苗苗（APV）制备中，去除内毒素是非常必要的一步。目前国内外广泛应用的蔗糖密度梯度超离心法（SDGC）需持殊设备，操作繁琐．使其应用受到限制。为此．我们应用DE。。往层析取代SDGC，结果表明，用DE。。层析处理百日咳菌抗原提取物，其内毒素可减少99．9％，而抗原量丢失仅7．4％。经PAGE及SDS－PAGE显示．处理后的抗原中仍主要含有FHA及IyT两种成分，且FHA及PT均含有3～5条多肽。解毒后制得三批苗苗，动物实验显示毒性检定合格，热原检定符合日本热原质规程要求，其效优（平均22．olU／111）与SDGC处理…     

膜滤特性对混凝-超滤组合去除双酚A的影响

针对水中的内分泌干扰物污染问题,研究了膜滤过程中膜孔径大小对双酚A(BPA)的去除特性,以及聚合氯化铝(PACl)混凝与超滤组合方法对BPA去除效能的影响。结果表明,膜孔径越小、初始BPA含量越小,BPA去除率越大,截留相对分子质量小于10~3的膜滤后BPA的最高去除率达到93.08%。在较广pH范围内(4.08、7.25和10.05),随着膜孔径增大,BPA的去除率逐渐减小,中性(pH=7.25)或酸性(pH=4.08)条件下更有利于膜滤去除BPA;PACl投加量为12 mg/L时,pH为7左右时,BPA去除率达到最大的37.68%。增加腐殖酸的含量并不利于BPA的去除。相较于单独的混凝或超滤工艺,混凝-超滤组合工艺有利于提高BPA的去除率并降低膜污染。     

吸附无细胞百白破疫苗生产用菌株主要保护性抗原基因序列的遗传稳定性及理化性质的稳定性

目的对吸附无细胞百白破疫苗生产用菌株的主要保护性抗原基因序列遗传稳定性及理化性质稳定性进行研究,为无细胞百白破疫苗的安全性和有效性提供依据。方法分别从百日咳、白喉和破伤风疫苗生产用菌株的主代、工作代、疫苗生产用工作种子(P1)、P2、P3(P1后再传2代)的菌体全基因组DNA中,扩增出百日咳主要抗原组分[百日咳毒素(pertussis toxin,PT)、外膜蛋白(pertactin,PRN)、丝状血凝素(filamentous hemagglutinin,FHA)]、白喉主要抗原[白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)原液]、破伤风主要抗原[破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)原液]的基因序列,克隆至p LB-Simple Vector,转化E.coli DH5α,测序后,运用DNAMAN软件与Gen Bank中登录的相应序列进行比对和分析。按照《中国药典》三部(2015版)相关方法,进行菌株理化性质稳定性检测。结果生产用百日咳、白喉、破伤风菌株的主代、工作代、P1、P2、P3的主要抗原基因序列大小及同源性与预期一致,理化性质稳定。结论吸附无细胞百白破疫苗生产用菌株的主要保护性抗原基因序列遗传稳定,理化性质稳定。     

百日咳毒素参考品的制备及鉴定

目的制备百日咳毒素(pertussis toxin,PT)参考品,并进行鉴定。方法将百日咳杆菌培养上清经珍珠岩和羟基磷灰石两步吸附层析纯化后获得PT,进行SDS-PAGE、ELISA、斑点免疫印迹及血凝效价检测。结果纯化后PT纯度可达99%以上;相同抗原含量的纯化后PT和NIBSC标准品与PT单克隆抗体均为阳性反应,与FHA单克隆抗体均为阴性反应;纯化后PT和NIBSC标准品均可与PT单克隆抗体产生明显的反应斑点,与FHA单克隆抗体无反应斑点,Sigma公司PT参考品与PT单克隆抗体有明显反应斑点,与FHA单克隆抗体有微弱反应斑点;纯化后PT和Sigma公司PT参考品的血凝效价分别为1∶32和1∶64。结论成功制备了较高纯度的PT,有望作为参考品用于PT抗原含量检测、抗PT血清抗体滴度检测及抗原纯度检测。     

无细胞百日咳疫苗研发与接种现状及前景

百日咳是传染性极强的呼吸系统疾病，主要影响婴幼儿。接种疫苗是预防百日咳感染的有效措施。无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccines,aPVs)因副作用更小，在许多国家已取代全细胞百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccines,wPVs)。尽管疫苗接种覆盖率较高，但aPVs的免疫力维持时间较短，被认为是百日咳重现的重要原因。针对百日咳疫苗的改进，基因脱毒疫苗及减毒活疫苗已取得了明显的临床效果，其他改进策略包括在现有aPVs中使用新型佐剂、增加抗原，或采用纳米颗粒包装等也具有良好的发展前景。本文就目前aPVs的抗原组分和保护效果，不同国家的接种程序，及潜在的百日咳疫苗候选组分和预防百日咳的新策略作一综述。     

CHO细胞簇集试验在无细胞百日咳疫苗质量控制中的应用

目的探讨CHO细胞簇集试验在无细胞百日咳疫苗质量控制中的应用。方法采用CHO细胞簇集试验比较分析不同来源的CHO细胞对百日咳毒素(pertussis toxin,PT)簇集活性。将豚鼠随机分为进口疫苗Lot 1~3实验组、国产疫苗Lot 4实验组、参考疫苗对照组,同时设未免疫对照组。分别于第0和21天,经豚鼠腹部皮下注射0.5 ml疫苗。于初免后第28天,经心脏采血,分离血清,采用ELISA法检测PT抗体滴度,CHO细胞簇集试验检测中和抗体滴度。结果 PT对不同来源的CHO细胞簇集能力存在一定差异,其中以来自ATCC的CHO细胞的簇集最敏感。各无细胞百日咳疫苗在豚鼠动物模型上均能诱导较好的PT抗体免疫反应,进口疫苗与参考疫苗及国产疫苗相比,差异均无统计学意义(P0.05);两种方法的检测结果具有一定的相关性,Spearman相关系数为0.474。结论证实了CHO细胞簇集试验用于百日咳疫苗纯化过程中质量控制和PT免疫原性分析的适用性,为加强和完善我国无细胞百日咳疫苗的质量控制奠定了基础。     

两级超滤部分纯化里氏木霉纤维素酶

研究了里氏木霉纤维素酶超滤过程中pH值的影响,结果显示适宜的pH为7.0。在pH 7.0的条件下,依次用PVDF100超滤膜和PS30超滤膜对纤维素酶粗酶液进行恒体积洗滤方式超滤,以洗出其中的杂蛋白,纯化之后的里氏木霉纤维素酶系中内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶分别被纯化了2.1、1.78和1.49倍,而且维持了里氏木霉纤维素酶系构成的稳定性。此时,相应酶组分的回收率分别为75.9%、81.8%和54.0%。     

提取百日咳保护性抗原的简易方法

用蓝色琼脂糖 CL—6B 做亲和吸附凝胶,仅用一步简单操作即可将1相百日咳菌在液体培养基中产生的 FHA 和 PT 抗原全部提纯出来。用 cs 菌株和 Tohama 菌株所得的提取物中,具有全部 FHA 和 PT 的生物学活性,共总抗原提取量二者没有区别,但 Tohama 菌株提取物的毒性略高于 cs 菌株。提取物中内毒素含量极微,未查出有凝集原存在。本方法为简化无细胞百日咳菌苗的研制过程提供了有利条件。     

百日咳杆菌无动物源培养基的筛选及其对百日咳毒素和丝状血凝素产量的影响

目的确定百日咳杆菌无动物源培养基最佳配方,并检测其对百日咳毒素(pertussis toxin,PT)和丝状血凝素(filamentous haemagglutinin,FHA)产量的影响。方法分别按一定比例混合使用或单独使用无动物源蛋白Hy Pep5603(小米和小麦蛋白)、精选大豆胨,替代培养基中动物源性成分(酸水解酪蛋白)作为氮源,进行百日咳杆菌摇瓶培养,比较细菌生长密度和产物生产量。以最高PT和FHA产量为参考标准,确定最佳培养基配方。用该配方与动物源培养基对比,进行4批30 L百日咳杆菌发酵培养;发酵液处理后,用离子交换层析分离PT和FHA样品,ELISA法测定各样品中PT和FHA的蛋白含量,SDS-PAGE法检测产物的相对分子质量大小。结果由无动物氮源Hy Pep56034.0 g/L、精选大豆胨6.0 g/L加改良SS培养基组成的培养基,摇瓶培养百日咳杆菌后最高A550为3.8,发酵百日咳杆菌后最高A550为5.8,均能有效地供菌体生长,且优于单独使用动物源或无动物源培养基;用该配方发酵百日咳杆菌并纯化,获得PT的产量约为5.7 mg/L,FHA产量约为23.0 mg/L,均高于用动物源培养基培养后的产物,且相对分子质量大小一致。结论用含Hy Pep5603 4.0 g/L、精选大豆胨6.0 g/L的无动物源培养基培养百日咳杆菌,可替代动物源培养基,用于PT和FHA的生产。     

重组人IL-12病毒去除/灭活工艺的建立及验证

目的建立重组人白细胞介素-12(recombinant human IL-12,rhIL-12)的病毒去除/灭活工艺,并进行验证。方法采用预过滤器(Viresolve Shield,纳米滤膜3.1 cm2)和除细小病毒过滤器(Viresolve Pro,纳米滤膜3.1 cm2)串联过滤,样品体积为90 ml,过滤时间为2 h,安全系数为1.88,压力为30 psi,建立rhIL-12病毒去除工艺,分析该工艺对产品的比活性及回收率的影响,并以猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)作为指示病毒,对该工艺进行病毒去除效果验证;采用低pH孵放法(用1 mol/L HCl调pH值至3.8±0.1,室温放置180 min后,用1 mol/L NaOH调pH值至7.4)建立rhIL-12病毒灭活工艺,分析该工艺对产品的蛋白含量及比活性的影响,并分别以水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)和伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)作为指示病毒,对该工艺进行病毒灭活效果验证。结果纳米膜串联过滤病毒去除工艺中,蛋白回收率为95.14%,比活性为过滤前的95.12%,对rhIL-12活性基本无影响;当滤出液达90 ml时,PPV下降滴度均大于4 log10,符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求。低pH孵放法病毒灭活工艺中,rhIL-12的蛋白含量在病毒灭活前后分别为359和338μg/ml,生物学活性分别为3.392×106和3.356×106 IU,均无明显变化;室温处理180 min后,指示病毒PRV、VSV的下降滴度均4 log10,符合《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》的要求。结论建立的rhIL-12膜过滤病毒去除工艺和低pH孵放法病毒灭活工艺均可有效地去除/灭活病毒,保证了产品的质量及安全性。     

应用戊二醛对百日咳抗原进行解毒的研究

本文报道应用戊二醛对百日咳保护性抗原解毒,并研究解毒条件与毒性及免疫原性的关系。在百日咳保护性抗原或无细胞百日咳菌苗的制造中,应用0.05%戊二醛(GA)于20℃作用4～6小时,再加入0.15～0.2%赖氨酸继续作用2小时,可以得到最佳解毒效果。用于制造无细胞百日咳菌苗符合菌苗检定要求,经37℃存放1个月后未见毒性逆转现象发生。     

超滤技术在红花黄色素提取中的应用研究

常规醇沉法提取生产红花黄色素流程长,工艺复杂.本文从超滤对红花提取液中主要杂质(蛋白、鞣质、多糖)的截留作用,从红花黄色素提取率以及超滤过程的操作稳定性方面探讨了超滤技术在红花黄色素提取中应用的可行性.通过实验发现,选用截留值(1～3)×104的聚砜超滤膜对提取液中的蛋白、鞣质有较好的截留效果,对多糖的截留效果不明显,超滤纯化后的红花黄色素质量与提取率明显优于醇沉法.同时超滤时料液的浓度和温度对操作的稳定性有较大影响,但控制合适的温度和浓度可得到较长时间的稳定操作时间.