鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法用差速离心纯化的IBV四川分离株Sczy3免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合。利用IBV鼠高免血清建立间接ELISA,筛选杂交瘤细胞。强阳性孔经有限稀释法亚克隆,获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并制备腹水。用鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单抗的亚型,Western blot法分析单抗的反应原性,ELISA法分析单抗的特异性及其与不同IBV毒株的交叉反应性。结果经连续4次亚克隆,获得2株能稳定传代并分泌抗IBV Sczy3株单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C8C1和2C10E7,其腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600。2株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgM亚型;均可特异性识别S1蛋白;2株单抗只与IBV发生特异性反应,与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型和AIV H5抗原均不反应,与其他5种基因型的10株IBV毒株均可产生交叉反应。结论成功制备了2株IBV S1蛋白单克隆抗体,为IBV的检测、抗原表位筛选及致病机理的研究等提供了材料。     

牛传染性鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)g E蛋白的单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gE基因插入至载体p ET-32a(+),转化感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白IBRV gE,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,间接免疫荧光法筛选阳性杂交瘤细胞。经小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,3×10~6个/只,待小鼠腹腔膨大后,采集腹水,硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体,并进行亚类、浓度、染色体数目、Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白IBRV gE相对分子质量约35 000,纯化后浓度为1.2 mg/mL。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后,筛选出1株稳定分泌IBRV单抗的杂交瘤细胞(命名为3G9),获得相应抗体浓度为1.46 mg/m L;为IgG1亚类,轻链为kappa链;染色体数目为95~105;可与IBRV发生特异性反应;可与接种IBRV毒株的MDBK细胞发生特异性结合,产生特异性荧光。结论采用原核表达系统表达并纯化了IBRV gE蛋白,成功制备了抗IBRV gE的单克隆抗体,为建立特异性的IBRV诊断方法及致病机理的研究奠定了基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法将扩增的IBRV gD基因插入原核表达载体p ET-28a(+),构建重组质粒gD-pET-28a,转化至感受态E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达重组蛋白gD,通过Ni-NTA Agarous Kit纯化后,免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,筛选阳性杂交瘤细胞,经小鼠腹腔注射,待小鼠腹腔膨胀时抽取腹水,用Hi Trap Protein G HP试剂盒纯化单抗,进行Western blot及间接免疫荧光检测。结果重组蛋白gD相对分子质量为48 000,纯化后浓度为4.19 mg/ml。小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后筛选出1株阳性杂交瘤细胞株,获得相应单克隆抗体的蛋白含量为1.81 mg/ml,且可与IBRV发生特异性反应,可与接种IBRV的MDBK细胞发生反应,产生特异性荧光。结论本研究利用原核表达系统表达纯化了IBRV gD蛋白,成功制备了IBRV gD单克隆抗体,为下一步表位鉴定及致病机理的研究奠定了基础。     

抗牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheities virus,IBRV)gD蛋白单克隆抗体,并鉴定其生物学特性。方法采用超速离心纯化的IBRV全病毒免疫BALB/c小鼠,取免疫后血清抗体呈阳性的小鼠脾细胞,通过融合剂PEG与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接免疫荧光法(IFA)筛选杂交瘤细胞,并制备腹水,分析单抗的生物学特性。结果筛选出1株稳定分泌抗IBRV gD蛋白单抗的杂交瘤细胞,命名为3C1。单抗的重链为IgG1亚类,轻链为kappa链;上清和腹水效价分别为1∶40和1∶12 800;单抗可与IBRV及gD重组蛋白分别在相对分子质量71 000和96 000处发生特异性反应,可与感染IBRV的MDBK细胞发生特异性结合,产生荧光。结论成功制备了抗IBRV gD蛋白的单克隆抗体,为深入研究gD蛋白功能及IBR的临床诊断方法筛选等提供了数据材料。     

呋喃妥因代谢物AHD单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备呋喃妥因代谢物AHD单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用对羧基苯甲醛合成1-氨基乙内酰胺脲(AHD)的衍生物1-氨基乙内酰脲-4-羧苯基肟(4-CPAHD),通过活性脂法将4-CPAHD与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,获得免疫抗原4-CPAHD-BSA和包被抗原4-CPAHD-OVA,采用紫外分光光度法检测偶联是否成功。将人工合成抗原4-CPAHD-BSA免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术将免疫小鼠脾脏细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,筛选能稳定产生抗体的细胞株;通过间接ELISA法检测该细胞株分泌的单克隆抗体的效价、邻硝基-PAHD(2-NPAHD)对单克隆抗体的半数抑制浓度(IC50),并分析抗体的特异性。结果偶联后4-CPAHD-BSA的最大吸收峰有较明显的偏移,表明4-CPAHD与BSA偶联成功,平均偶联比为17.4∶1。制备的单克隆抗体的效价为1∶64 000,2-NPAHD对单克隆抗体的IC50为1.45μg/L,单克隆抗体与同类抗生素及其代谢物无交叉反应。结论制备的AHD单克隆抗体各项指标均较好,为呋喃妥因代谢物免疫检测试剂的研发奠定了基础。     

新城疫病毒F蛋白与鸡传染性支气管炎病毒S1蛋白的共表达、纯化及免疫原性

目的共表达新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F蛋白与鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis virus,IBV)S1蛋白,纯化并分析其免疫原性。方法根据NCBI中NDV F及IBV S1片段基因序列,截取包含F及S1蛋白部分抗原表位基因片段,设计并合成引物,PCR扩增目的片段,依次连接至原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-32a-F-S1,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达,并对IPTG浓度和诱导时间进行优化,SDS-PAGE分析目的蛋白可溶性;重组蛋白经Ni-NTA agarose层析纯化复性后,Western blot法检测其反应原性。将14日龄雏鸡随机分F-S1、NDV F、IBV S1及PBS组,肌内免疫3轮,间隔10 d,每轮连续免疫5 d,每日1次,100μg/只,首次免疫后每隔7 d采集血清,ELISA法检测雏鸡血清特异性IgG水平。结果经双酶切鉴定,重组质粒p ET-32a-F-S1构建正确。重组蛋白最适IPTG诱导浓度为0. 2 mmol/L,时间为3 h;其以包...     

猪血凝性脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)单克隆抗体,并进行鉴定。方法通过差速离心和蔗糖密度梯度离心法对猪HEV进行纯化,免疫BALB/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞进行融合,经间接ELISA和血凝抑制试验(HI)筛选能稳定分泌抗HEV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单抗进行生物学鉴定。结果筛选出4株能稳定分泌抗HEV单抗的杂交瘤细胞株2H2、2A1、1E2、4D4。经鉴定,4株杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水抗HEV的ELISA效价可达1∶12800～1∶51200,其中3株HI效价可达1∶24～1∶28,另1株为0。4株杂交瘤细胞分泌的单抗与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)均不发生交叉反应;杂交瘤细胞染色体数为83～103;除2A1单抗为IgG2b外,其他3株均为IgG1;Westernblot分析表明,2H2、2A1和4D4能识别HEV的血凝素-酯酶蛋白(HE),1E2可识别纤突蛋白(S)。结论已成功制备出抗HEV的单克隆抗体,为HEV快速检测试剂的研制奠定了基础。     

抗Ⅰ型脊髓灰质炎病毒单克隆抗体的制备

目的制备抗脊髓灰质炎病毒单克隆抗体,为ELISA检测方法的建立奠定基础。方法将Ⅰ型脊髓灰质炎减毒疫苗原液和灭活疫苗原液经超滤、超离纯化,以纯化的减毒脊髓灰质炎病毒D抗原免疫BALB/c小鼠,得到的脾细胞与SP2/0-A14小鼠骨髓瘤细胞融合,以纯化的灭活脊髓灰质炎病毒D抗原建立间接ELISA法,筛选分泌特异性单抗的阳性细胞株,诱生小鼠腹水,通过正辛酸-硫酸铵法纯化抗体,并进行各项鉴定。结果获得两株稳定分泌抗脊髓灰质炎病毒单抗的细胞株7G5及5E4。纯化的7G5和5E4株单抗分别可与脊髓灰质炎病毒D抗原的VP2、VP3衣壳蛋白结合;在不同温度下放置均比较稳定;pH4不利于7G5株单抗的保存;5E4株单抗的相对亲和力大于7G5株;7G5株单抗的亚类为IgM,5E4株单抗的亚类为IgG2a;两株单抗可识别相似表位;7G5株和5E4株单抗的中和效价分别为1:64和1:128。结论已成功制备了两株分泌抗脊髓灰质炎病毒的单抗。     

传染性支气管炎病毒中和表位研究进展

传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)能引起急性、高度接触性传染病,严重危害全球家禽业。目前主要通过接种疫苗来控制该病,但效果不佳。中和表位能使中和抗体与相应抗原相互作用,中和抗体能抵御病毒感染、消除病毒并防止病毒传播和扩散,在免疫中发挥重要的作用。因此鉴别出中和表位对预防和控制疾病以及有效疫苗和诊断试剂的发展十分重要。本文主要通过该病毒的四个结构蛋白来介绍其中和表位,以期对IBV中和表位的深入研究提供参考。     

抗SARS刺突蛋白单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗SARS病毒表面刺突蛋白单克隆抗体,用于SARS研究。方法大肠杆菌中表达的SARS-S2蛋白经纯化后免疫小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,制备单克隆抗体,并进行ELISA和Westernblot鉴定。结果所制备的抗SARS病毒表面刺突蛋白单克隆抗体,能与表达的SARS-S2蛋白发生特异性结合。结论已获得了抗SARS病毒表面刺突蛋白单克隆抗体。     

抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。     

玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及鉴定

采用玉米赤霉烯酮(ZEN)与羧甲基羟胺半盐酸盐在吡啶中反应,生成玉米赤霉烯酮肟(ZENO),用活性酯法将ZENO与牛血清白蛋白(BSA)的氨基相连合成ZEN人工抗原;并进行了紫外吸收鉴定;以合成的BSA偶联物(ZEN-BSA)为免疫抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合,采用非竞争/竞争ELISA两步筛选法获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株1C7.抗体1C7灵敏度(IC50)达0.61μg/L,与T-2毒素、呕吐毒素(DON)、黄曲霉毒素(AFT)的交叉反应率均＜0.1％.本研究为研发粮油产品中玉米赤霉烯酮特异性免疫分析技术及产品奠定了重要基础.     

牛坏死杆菌43K OMP单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备牛坏死杆菌43KOMP单克隆抗体,并鉴定其生物学特性.方法 经IPTG诱导表达重组43KOMP,纯化后免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗43K OMP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗43K OMP单克隆抗体进行效价、亚类、免疫原性及特异性鉴定.结果 获得3株稳定表达抗43...     

肾综合征出血热病毒84-Fli株单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndromes,HFRS)病毒特异性单克隆抗体。方法以汉坦病毒84-Fli株抗原纯化液免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术获得单克隆抗体,利用IFA、SDS-PAGE和Western blot法鉴定其生物学特性。结果成功筛选出阳性杂交瘤细胞株4F6,能稳定且持续分泌抗HFRS病毒的单克隆抗体,亚类鉴定结果为IgM,可与HFRS病毒蛋白在相对分子质量约50 000处发生特异性反应,具有较好的专属性。结论成功制备了1株抗HFRS病毒的单克隆抗体,为进一步研究该病毒感染的诊断、治疗及其预防方法奠定了基础。     

甲型副伤寒细菌单克隆抗体的制备及其初步应用

目的制备甲型副伤寒特异性多糖(O-specific polysaccharide,O-SP)单克隆抗体,建立鉴定甲型副伤寒沙门血清型细菌的全菌体ELISA和O-SP的竞争ELISA定量检测方法。方法用甲型副伤寒全菌体免疫小鼠,通过常规方法融合,以破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)为载体偶联的O-SP为筛选检测抗原,间接ELISA法筛选分泌抗甲型副伤寒O-SP的特异性抗体杂交瘤细胞株;分别以甲型和乙型副伤寒的O-SP-TT及伤寒Vi-TT为包被抗原,检测制备的单克隆抗体与不同血清型细菌多糖的交叉反应;以不同沙门菌菌体为包被抗原,用制备的1株甲型副伤寒O-SP特异性单克隆抗体进行菌体间接ELISA,检测细菌血清型;用该株单克隆抗体为竞争抗体,建立定量检测样品中O-SP的竞争ELISA方法。结果筛选出6株分泌抗甲型副伤寒O-SP抗体的杂交瘤阳性细胞株;其中2株仅与甲型副伤寒O-SP呈特异性反应,其余4株与乙型副伤寒O-SP呈交叉反应;用其中1株单克隆抗体进行的菌体间接ELISA显示,该株单克隆抗体仅与甲型副伤寒沙门菌反应,而不与伤寒沙门菌、乙型副伤寒沙门菌和肠炎沙门菌反应;竞争ELISA定量检测O-SP的检测范围在0.4~0.003 2μg/ml最准确。结论制备的特异性抗甲型副伤寒O-SP的单克隆抗体可用于甲型副伤寒细菌血清型快速鉴定和O-SP的竞争ELISA定量检测。