鲜地黄中β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶的分离纯化和性质研究

目的从鲜地黄分离纯化β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶,并研究其性质。方法通过磷酸盐缓冲液提取、两步硫酸铵盐析和两步凝胶柱层析,分离纯化鲜地黄中β-葡糖苷酶和α-半乳糖苷酶。以pNPG为底物,研究两种酶的最适反应温度及温度稳定性。结果与结论从鲜地黄中分离得到1种β-葡糖苷酶和3种α-半乳糖苷酶同工酶。研究发现β-葡糖苷酶热稳定性较差,在50℃即迅速失活;而α-半乳糖苷酶在50℃总酶活性最高,热稳定性较好,70℃以上时活性迅速下降。     

α-鼠李糖苷酶最佳测定条件的建立及酶学性质研究

对α-鼠李糖苷酶酶活的最佳测定条件及部分酶学性质进行了研究,结果表明,α-鼠李糖苷酶的最佳测定条件为:以pH4.1的磷酸氢二钠-柠檬酸为缓冲液,5mmol/L的pNP-Rha为底物,于45℃恒温水浴中反应4min,立即加入2ml1mol/LNa2CO3溶液终止反应,400nm测定其O.D值。α-鼠李糖苷酶适于酸性环境,最适pH4.1;该酶为热不稳定性酶,其稳定的温度范围为35～55℃;以pNP-Rha(对硝基苯基-鼠李糖苷)为底物,Km值为47.84mmol/L,Vmax为75.12U。     

α-鼠李糖苷酶最佳测定条件的建立及酶学性质研究

对α-鼠李糖苷酶酶活的最佳测定条件及部分酶学性质进行了研究,结果表明,α-鼠李糖苷酶的最佳测定条件为:以pH4.1的磷酸氢二钠-柠檬酸为缓冲液,5mmol/L的pNP-Rha为底物,于45℃恒温水浴中反应4min,立即加入2ml1mol/LNa2CO3溶液终止反应,400nm测定其O.D值。α-鼠李糖苷酶适于酸性环境,最适pH4.1;该酶为热不稳定性酶,其稳定的温度范围为35～55℃;以pNP-Rha（对硝基苯基-鼠李糖苷）为底物,Km值为47.84mmol/L,Vmax为75.12U。      

海栖热袍菌α-葡萄糖苷酶基因aglA的克隆、表达及酶学性质

主要研究了在大肠杆菌中克隆和表达海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的一个α-葡萄糖苷酶(TM1834).通过PCR方法克隆编码T.maritima的一个α-葡萄糖苷酶基因aglA,构建重组质粒pHsh-AglA,电击转化Escherichia coli JM109,通过热激诱导高效表达.SDS-PAGE检测出蛋白相对分子质量约55 000,经热处理,阴离子交换层析和疏水层析纯化后的α-葡萄糖苷酶最适反应温度为90℃,最适反应pH为7.5,在pH 6.5～8.5,温度65～100℃之间酶活仍达到50％以上.在辅助因子NAD+,Mn2+和还原剂DTT的存在条件下达到最高酶活.     

α-阿拉伯糖苷酶的酶动力学性质研究

对α-阿拉伯糖苷酶的酶动力学性质进行了研究,结果表明:α-阿拉伯糖苷酶最适温度65℃、最适pH4.2、酶反应时间4min。α-阿拉伯糖苷酶在pH3.8~4.6的中等酸度条件下稳定,α-阿拉伯糖苷酶的热稳定性较好。Zn2 、Mg2 、Ca2 、Fe3 等重金属离子以及pCMB对α-阿拉伯糖苷酶有抑制作用,EDTA对α-阿拉伯糖苷酶有激活作用。α-阿拉伯糖苷酶的最大反应速度Vmax为20.08μmol/min,米氏常数Km为14.06mmol/L。     

乳酸片球菌AS1.2696来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质分析

克隆表达乳酸片球菌AS1.2696菌株中的α-L-鼠李糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质。分析乳酸片球菌AS1.2696菌株的全基因组序列,聚合酶链式反应扩增目的基因,以pSE380为表达载体构建重组质粒pSE-prha2和pSE-prha3,在大肠杆菌Escherichia coli XL-blue进行表达,使用镍亲和层析纯化重组蛋白,研究重组酶PRHA2、PRHA3的酶学性质。结果表明,重组酶PRHA2的最适pH值和温度分别为5.0和60?℃,Km值为（3.039±0.581）mmol/L,Vmax值为（2.032±0.186）μmol/（min·mg）;PRHA3的最适pH值和温度分别为5.5和45?℃,Km值为（2.797±0.132）mmol/L,Vmax?值为（113.35±1.485）μmol/（min·mg）。PRHA2和PRHA3能够水解人工底物对硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnopyranoside,pNPR）以及α-1,6键的橙皮苷、芦丁;PRHA2对4-硝基苯基-β-D-阿拉伯糖苷（4-nitrophenyl-β-L-arabinoside,pNPA）有一定的水解活性;PRHA3对淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C这几种物质C-7位的葡萄糖糖苷键有较弱的水解作用。此外,PRHA3能够水解朝藿定C的C-3位以α-Rha(2→1)α-Rha连接的外侧的鼠李糖苷键,在食品及医疗方面具有一定的应用价值。     

α-L-鼠李糖苷酶以催化活性包涵体形式异源表达及其酶学性质

从解肝磷脂土地杆菌（Pedobacter heparinus）基因组DNA扩增获得两个α-L-鼠李糖苷酶基因PhRha78E和PhRha78G,构建于表达载体pET-28a;将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）进行异源表达,PhRha78E和PhRha78G以不溶性包涵体形式大量表达于沉淀中,每克菌体可分别获得0.42?g和0.39?g含目的酶包涵体的沉淀。酶活实验显示二者的不溶性包涵体具有催化活性,可以催化水解底物对硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenol-α-L-rhamnopyranoside,PNPR）,表明二者在大肠杆菌中以催化活性包涵体形式异源表达。PhRha78E和PhRha78G的最适反应pH值相近,分别为6.5和7.0,PhRha78E在酸性pH?4.8仍能保持62%酶活力,而PhRha78G在碱性pH?8.6依然保持72%酶活力;PhRha78E和PhRha78G的最适反应温度却相差很大,分别为60?℃和40?℃,PhRha78E在高温70?℃条件下仍能保持69%酶活力,而PhRha78G在低温20?℃条件下仍有43%酶活力;动力学常数kcat分别为0.18?s－1和0.12?s－1,Km分别为0.55?mmol/L和0.40?mmol/L。本研究揭示新型α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E和PhRha78G在大肠杆菌中以催化活性包涵体形式异源表达,蛋白表达量大,二者酶学性质差异较大,可应用于不同的生物催化领域,并丰富了现有α-L-鼠李糖苷酶资源库。     

水生栖热菌FL-03海藻糖合酶基因克隆及原核表达

海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS)属于α-淀粉酶家族(α-amylase family),是生物体内通过TreS途径生成海藻糖的一种酶类。利用PCR技术,从水生栖热菌FL-03菌株FL-03中扩增了海藻糖合酶基因(TresC01),将其克隆到原核表达载体pET-28a(+),得到重组质粒P-TresC01,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,重组蛋白经SDS-PAGE分析,得到一条分子量约为110ku的特异条带,并经Western blotting分析鉴定,表明成功构建重组质粒P-TresC01并在大肠杆菌中表达,为进一步的研究奠定基础。     

壳聚糖酶的基因克隆表达及酶学性质研究

作者从NCBI数据库中挖掘到来源于Butyrivibrio sp. MC2013的壳聚糖酶基因,命名为BUT,该壳聚糖酶基因大小为903 bp,编码301个氨基酸。通过NCBI数据库和进化树比对发现,该壳聚糖酶（BUT）属糖苷水解酶46家族（后简称GH-46）,与其它壳聚糖酶相似度为59%,是一种新型的壳聚糖酶。序列经密码子优化后进行全基因序列合成,与表达载体pET21a（+）连接构建重组质粒pET-21a-BUT,转入大肠杆菌E. coli BL21（DE3）表达宿主,进行诱导表达。所得重组壳聚糖酶通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,SDS-PAGE确定其蛋白分子量为35 kDa,DNS法测定其酶活为146.0 U/mg。对BUT酶的酶学性质进行探究,结果表明BUT酶最适温度和pH分别为45 ℃、8.0,在中性偏碱性条件下稳定性较强。Mn2+对其酶活力具有促进作用,SDS、Fe3+、Cu2+、Zn2+等的抑制作用极强。通过TLC对其水解产物分析发现,BUT水解壳聚糖的产物是壳二糖、壳三糖和壳四糖。     

褐色喜热裂孢菌Thermobifida fusca产麦芽糖α-淀粉酶基因的克隆表达及酶学性质研究

以T.fusca基因组DNA为模板,PCR分别扩增不包括和包括其基因前段信号肽的产麦芽糖淀粉酶的基因片段tfa和sptfa,并克隆至表达载体pSE380上,获得重组质粒pSE380-tfa和pSE380-sptfa,以大肠杆菌JM109为宿主细胞大量表达融合蛋白,利用金属镍亲和层析对菌株JM109/pSE380-tfa表达的α-淀粉酶进行纯化,SDS-PAGE显示纯化蛋白的分子量约为64ku,K m值为1.305mg/mL,最适反应温度为60℃,最适pH为7.0;检测到菌株JM109/pSE380-sptfa的培养基上清有相当一部分酶活。本研究麦芽糖α-淀粉酶与可溶性淀粉反应,经HPLC检测产物均为麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖的混合物。因此麦芽糖α-淀粉酶在生产高麦芽糖浆上起到了一定的作用。      

Thermotoga neapolitana α-葡萄糖苷酶基因克隆及表达

本文拟克隆新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana DSM 4359)的一种α-葡萄糖苷酶基因(TNAG),其GenBank注册号为lcl27401。首先以T.neapolitana DSM 4359基因组DNA为模板,通过PCR扩增目的基因并完成T克隆,在NCBI数据库中比对结果表明:目的基因与Thermotoqa sp.RQ2等氨基酸序列相似度高于99%。再将目的基因连接至表达载体pET-32a(+),并导入大肠杆菌Rosetta中用IPTG诱导表达。SDS-PAGE显示表达蛋白的大小约为72KDa。热纯化后酶液测活反应的最适温度为80℃,最适pH在5.0左右。     

Sulfolobus tokodaii strain 7高温酸性α-淀粉酶基因在大肠杆菌中克隆表达及其酶学性质

以超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain 7基因组DNA为模板,通过PCR扩增高温酸性α-淀粉酶基因ST0817,将此基因克隆至表达载体pET15b,并转化大肠杆菌Escherichia coli BL21-CodenPlus(DE3)-RIL,获得重组大肠杆菌工程菌。通过热处理、镍柱亲和层析和分子筛层析,得到纯化重组酶,SDS-PAGE分析表明,该酶分子量为53.0 kDa。酶学性质研究表明,该酶最适温度和pH分别为75℃和5.5;具有较强的热稳定性和pH稳定性,在85℃处理8 h保持50%左右活力,在pH 5.2处理120 min仍保持50%活力。此酶对不同底物水解活性不同,直连淀粉>可溶性淀粉>支链淀粉>β-极限糊精>糖原>环糊精>普鲁兰糖;该酶对有机溶剂、变性剂和金属离子具有一定抗性。     

响应面法优化淀粉葡糖苷酶的酶反应体系

为建立并优化淀粉葡糖苷酶的酶反应体系,通过单因素分析和响应面实验设计,以淀粉葡糖苷酶能够直接作用的天然底物即淀粉为作用对象,以反应速度为指标,考察可溶性淀粉浓度、淀粉葡糖苷酶浓度、反应时间3 个因素对酶促反应速度的影响.结果表明,所建立淀粉葡糖苷酶的最佳酶反应体系为可溶性淀粉质量浓度10.30 mg/mL、淀粉葡糖苷酶...     

热稳定性α-阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶的纯化

α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶对来源于被子植物的木聚糖类半纤维素的生物降解和转化是必不可少的。文中首次报道了国内对该酶的研究。α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶的基因工程菌在发酵罐中以LB为基质进行生长 ,以乳糖为诱导剂 ,所产生的α 阿拉伯糖苷酶 /木糖苷酶在 70℃热处理 3 0min后、经DEAE Sephacel阴离子柱层析、金属Ni2 + 的亲和层析等提纯步骤 ,达到了电泳纯 ,提纯倍数为 49 3倍 ,收率为 2 0 4%。SDS PAGE法测定α 阿拉伯糖苷酶/木糖苷酶的分子质量为 85ku ,与理论推算值相吻合     

产α-L-鼠李糖苷酶细菌Bacillus velezensis的筛选及酶学性质研究

L-鼠李糖苷酶广泛应用于食品加工、医药及医药前体的制备。研究从海洋样品中筛选产α-L-鼠李糖苷酶的细菌,对菌株进行鉴定,并对α-L-鼠李糖苷酶粗酶性质进行测定。通过透明圈平板筛选法从海州湾海域海泥样品中筛选获得一株产α-L-鼠李糖苷酶的细菌菌株DTC03。通过形态学特征、生理生化特性,以及16SrDNA序列的扩增与分析,将菌株DTC03鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。对菌株DTC03α-L-鼠李糖苷酶粗酶液酶学性质进行测定,该酶最适催化温度和pH分别为40℃和pH7.0;在50℃范围内保持1h后,剩余酶活力高于50%;在pH6.0～8.0的缓冲液放置12h后,仍有60%以上酶活。金属离子Ba~(2+)和Al~(3+)对酶有显著激活作用,而Ni~(2+)、Cu~(2+)和Cd~(2+)对酶有显著抑制作用。目前尚未见Bacillus velezensis产α-L-鼠李糖苷酶的报道,研究结果为该酶的进一步研究奠定实验基础。     

耐酸性高温α-淀粉酶突变基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用表达载体pET-30a,实现了去信号肽的耐酸性高温α-淀粉酶突变基因amyd及未突变的高温α-淀粉酶基因amy在大肠杆菌BL21(DE3)中的高效表达。经多步纯化,重组酶AMY及AMYD的比活分别达到312.7U/mg蛋白和354.6U/mg蛋白,纯化倍数分别为75.90和83.83,获得凝胶电泳条带单一的蛋白样品,经SDS-PAGE检测,AMY及AMYD酶分子质量均为63.5ku。重组酶AMY的最适温度80℃,最适反应pH为6.5,在温度低于90℃,反应pH5.5~7时,酶活较稳定。重组酶AMYD的最适温度80℃,最适反应pH为4.5,在温度低于90℃,反应pH4.0~6.5时,酶活较稳定。     

真菌α-淀粉酶酶学性质研究

真菌α-淀粉酶是淀粉生产麦芽了对比研究.结果表明:两种酶最佳试验稀释倍数为1000;最适pH值均为5.5;在50℃以下时热稳定性较好,高于60℃时酶活损失较多;Ca2 浓度在7mmol/L时对两种酶都有激活作用.     

α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,成功异源表达了一株链球菌（Streptococcus）S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50 ℃,在碱性环境中（pH 7.5～10.0）及在40 ℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）的最大水解速率（Vmax）为508.38 μmol/（min·mg）,米氏常数（Km）值为1.2 mmol/L;通过薄层层析（TLC）法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。     

α-转移葡萄糖苷酶的酶学性质研究

α-转移葡萄糖苷酶是生产低聚异麦芽糖的关键酶。研究表明,需将该酶稀释到一定倍数,反应一定时间,可达到产物中含有较高的低聚异麦芽糖。该酶的最适pH为5.0,最适反应温度为65℃,不同金属离子对该酶酶活的影响不同。正交实验确定该酶的最佳反应pH为4.15,温度为60℃,时间为3h。     

α-转移葡萄糖苷酶的酶学性质研究

α-转移葡萄糖苷酶是生产低聚异麦芽糖的关键酶。研究表明,需将该酶稀释到一定倍数,反应一定时间,可达到产物中含有较高的低聚异麦芽糖。该酶的最适pH为5.0,最适反应温度为65℃,不同金属离子对该酶酶活的影响不同。正交实验确定该酶的最佳反应pH为4.15,温度为60℃,时间为3h。