肉桂醛特异性抑制酵母细胞壁合成的作用机理

基于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及其细胞壁合成酶缺陷突变株组成的筛选模型对肉桂醛抗真菌的作用机制进行了研究。发现肉桂醛对细胞壁合成酶基因缺陷突变株及其野生型的抑制具有显著差异,对葡聚糖合酶缺陷突变株Δfks1的最低抑制浓度MIC值为8μg/mL,比野生型低8倍,肉桂醛对几丁质合酶基因缺陷突变株CHS020和CHS003的MIC值也比野生型低4倍。肉桂醛对Δfks1生长的抑制能被山梨醇等渗溶液部分挽救,经肉桂醛处理后,Δfks1的β-葡聚糖和几丁质含量分别降低了23.48%和31.94%。研究结果表明,肉桂醛特异性抑制真菌细胞壁葡聚糖和几丁质的合成是其抑制真菌细胞生长的主要机制之一。     

酶法测定大麦提取物中β-葡聚糖含量的研究

在国际β-葡聚糖酶法测定β-葡聚糖含量的基础上,用纤维素酶代替昆布多糖水解酶水解β-葡聚糖,用β-葡聚糖酶代替β-葡萄糖苷酶,用苯酚-硫酸法代替葡萄糖试剂盒法测定β-葡聚糖酶解后得到葡萄糖含量,设计了适合我国应用的β-葡聚糖酶法测定方法。此法测定过程为：1．5mL浓度为60μg/mL的标准β-葡聚糖和一定浓度的样品,用浓度为50U/mL纤维素酶0．5mL酶解60min；然后用蒸馏水稀释至30mL,从中吸取0．5mL到另一试管,再加入浓度为2U/mLβ-葡聚糖酶1mL,作用15min后,用苯酚-硫酸法测定标准β-葡聚糖和样品酶解液中葡萄糖含量,计算出样品中β-葡聚糖的含量。     

基因突变提高毕赤酵母表达内切β-1,3-葡聚糖酶活性

为构建一株高效表达内切β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母菌株,并用于水解热凝胶生产β-1,3-葡寡糖。作者首先对哈茨木霉来源内切β-1,3-葡聚糖酶基因进行随机突变,并构建BGN13.1a突变库;然后采用高通量技术及刚果红平板筛选高表达菌株;最后采用TLC薄层色谱和MALDI-TOF MS分析热凝胶水解产物,并分析了酶学性质。结果表明,本研究成功筛选得到毕赤酵母突变株K827,酶活较初始菌株提高了25%;其水解产物聚合度为2～10,且寡糖产量为1.492 g/L;其最适pH与最适温度分别为5.5和50℃;相较亲本酶,突变株K827的pH稳定性与温度稳定性都有明显提高。本研究为内切β-1,3-葡聚糖酶的工业化生产及应用提供依据。     

HPLC法测定香草胃康胶囊中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量

为了采用高效液相色谱法测定香草胃康胶囊中木香烃内酯和去氢木香内酯的含量。通过采用YMC-Pack Polymer C18(250×4.6mm 5μm)色谱柱;甲醇-水(65:35)为流动相;检测波长为225nm。得出木香烃内酯和去氢木香内酯分别在20~960μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。木香烃内酯和去氢木香内酯的平均回收率分别为99.5%,99.6%。证明本方法是种简便、准确、安全的测定香草胃康胶囊含量的方法。     

酶法测定大麦提取物β-葡聚糖含量研究

目前国际认可β-葡聚糖含量测定方法是酶法,此法测定成本高,我国目前多采用苯酚- 硫酸法测定,但测定结果准确性较差。该研究在国际β-葡聚糖酶法测定基础上用纤维素酶代替昆布多糖水解酶水解β-葡聚糖,用苯酚-硫酸法代替葡萄糖试剂盒法测定β-葡聚糖酶解后得到葡萄糖含量,设计适于我国应用的β-葡聚糖酶法测定方法。此法测定过程为:1．5 ml浓度为60μg／mL 标准β-葡聚糖和一定浓度样品,用浓度为50U／mL纤维素酶0．5 ml酶解60 min;然后用蒸馏水稀释至30 ml,从中吸取0．5 ml到另一试管,再加入浓度为2 U／mL β-葡聚糖酶1ml,作用15 min后,用苯酚-硫酸法测定标准β-葡聚糖和样品酶解液中葡萄糖含量,计算出样品中β-葡聚糖含量。     

泡盛曲霉液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件优化

从土壤样品中筛选得到一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌,经鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori),命名为Aspergillus awamori CAU33。依次采用单因素试验和响应面分析法优化了其液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件,得到该菌株产酶的最适条件为:玉米芯质量浓度55 g/L、大豆蛋白胨质量浓度25 g/L、曲拉通X-114质量浓度23 g/L、初始pH 4.5、培养温度35℃、培养时间6 d。在此条件下β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到8 447 U/m L,为优化前的17.6倍。     

代谢工程改造酿酒酵母高效合成β-葡聚糖

β-葡聚糖是存在于酵母细胞壁中的一种多糖,具有抗炎抗氧化等重要的作用。为提高酿酒酵母中β-葡聚糖的产量,该研究采用代谢工程中常用的“推-拉-抑制”策略。首先,通过在酿酒酵母中过表达β-葡聚糖合成途径关键酶及其调节亚基“拉”动关键前体二磷酸尿苷(uridine diphosphate, UDP)-葡萄糖流向β-葡聚糖合成途径;之后通过强化前体UDP-葡萄糖途径酶,将代谢通量“推”向前体UDP-葡萄糖的有效合成;最后抑制蛋白质糖基化等UDP-葡萄糖的其他消耗途径,积累更多的UDP-葡萄糖用于目的产物β-葡聚糖的合成。除此之外,通过引入木糖还原酶基因xyl1,木糖醇脱氢酶基因xyl2和木酮糖激酶基因xyl3,构建了木糖氧化还原途径;进一步通过过表达转运蛋白Hxt7(F79S),敲除snf1基因,提高了对木糖的利用能力,并最终将β-葡聚糖的产量提高至86.09 mg/g。最后,利用半乳糖诱导型启动子P_gal1动态调控内切葡聚糖酶基因(eng1)表达,使酿酒酵母中β-葡聚糖的分子质量从1×10⁶～2×10⁶ g/mol降低至1.2...     

响应曲面法优化酵母β-葡聚糖酶解工艺及产物分析

采用β-葡聚糖酶对酵母β-葡聚糖进行酶解,利用单因素和响应面实验,以水溶性酵母β-葡聚糖得率为指标优化酶解工艺,并对水溶性酵母β-葡聚糖与原酵母β-葡聚糖的结构和热稳定性进行了研究。最佳酶解条件:底物质量浓度1.14 g/100 mL,酶活浓度0.16 U/mL,温度44℃,pH 4.2,水溶性酵母β-葡聚糖得率为39.89%。红外光谱分析结果表明,水溶性酵母β-葡聚糖与原酵母β-葡聚糖的糖苷键型均为β构型,分子构象相同。热稳定性分析表明,水溶性酵母β-葡聚糖和原酵母β-葡聚糖的特征分解温度分别为356℃和360℃,终止分解温度分别为740℃和780℃,热稳定性差异不大。     

苯酚-硫酸法测定β-葡聚糖含量研究

分别以β-葡聚糖和葡萄糖为标准品测定青稞提取物中β-葡聚糖含量。以β-葡聚糖为标准品时,线性浓度范围在6～13μg/mL,回归方程为y=0.0445X-0.0071,回归系数为R2=0.9568,青稞中提取β-葡聚糖粗提物纯度为22.3%(脱脂)和10.7%(未脱脂);以葡萄糖为标准品时,线性浓度范围在0-21μg/mL,回归方程为y=0.0588X+0.0326,回归系数为R2=0.9934,青稞中提取出β-葡聚糖粗提物纯度为12.5%(脱脂)和4%(未脱脂),二者之间测定结果有78.4%左右误差。在β-葡聚糖含量测定过程中不能用葡萄糖代替β-葡聚糖作标准品,用β-葡聚糖作标准品时苯酚-硫酸法工作曲线线性回归性不强,直接用苯酚-硫酸法测定β-葡聚糖方法不可取。     

Dfg5在酿酒酵母细胞壁合成中的功能分析

酿酒酵母中合成的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-APs)一半停留在细胞膜上,另一半被转运至细胞壁的β-1,6-葡聚糖上形成GPI锚定细胞壁蛋白(CWPs)。有分析指出,Dfg5和Dcw1是定位于细胞膜的GPI锚定蛋白,可能以同工酶的形式参与GPI-APs转运。但这两个同源蛋白的分子作用机制尚不清楚。为探究Dfg5的作用机制,本研究构建了dfg5△PMET3DCW1条件突变菌株。研究发现在DCW1表达抑制型突变株中Cwp1在细胞膜上大量积累。对Dfg5中与甘露糖苷酶催化活性相关保守氨基酸位点分别定点突变,产生的突变蛋白Dfg5~(W71A)、Dfg5~(D122A)、Dfg5~(D123A)无法回补条件突变株的生长缺陷。然而截断Dfg5前导肽的分泌型Dfg5则可回补条件突变株的生长缺陷。上述结果可推测在GPI-APs锚定至细胞壁中,Dfg5至少具有糖苷酶,可将Cwps从细胞膜上的GPI锚中释放出来。     

特基拉芽孢杆菌来源β-1,3-1,4-葡聚糖酶重组菌发酵培养基的优化

为了提高重组大肠杆菌(Escherichia coli BL21DE3)(pET-28a(+)-bgl)发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的能力,研究了发酵培养基中各类碳源及氮源的影响,并通过响应面分析法优化培养基各组分的含量。结果表明,甘油为最适碳源,酵母粉及胰蛋白胨为氮源。优化的培养基组成是:yeast extract终浓度为20 g/L,胰蛋白胨12.5 g/L,甘油14.1 mL/L,KH2PO42.17 g/L,K2HPO42.74 g/L。三角瓶发酵产β-葡聚糖酶酶活(2 978.2 U/mL),与初始培养基(1 671.9 U/mL)相比,提高了1.78倍。研究结果表明,发酵培养基的优化对重组大肠杆菌发酵生产工业酶具有重要作用。     

酵母β-葡聚糖水解酶的表达及应用

酵母β-葡聚糖是一种具有多种生物功能的细胞壁结构多糖,但天然的酵母β-葡聚糖水溶性较差,影响了其在医疗、保健食品和化妆品行业中的应用。作者通过β-1,3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1,6-葡聚糖水解酶BT3312水解酵母β-葡聚糖制备小分子酵母葡聚糖,提高其水溶性。以大肠杆菌为宿主,异源表达β-1,3-葡聚糖水解酶Gly5m和β-1,6-葡聚糖水解酶BT3312。在25℃条件下,添加0.2 mmol/L IPTG诱导后,Gly5m和BT3312的最高酶活分别为1 086 U/mL和2 355 U/mL。酵母β-葡聚糖经过Gly5m和BT3312水解后,溶解率分别提高了2.6倍和2.4倍。采用Gly5m和BT3312共同水解,酵母β-葡聚糖溶解率提高了3.2倍(水溶性酵母葡聚糖的质量浓度为12.5 g/L)。因此,Gly5m和BT3312在提高酵母葡聚糖的水溶性和制备小分子酵母葡聚糖领域具有重要的应用价值。     

木霉LE02 β-1，3-葡聚糖酶酶学特性的研究

对木霉菌株LE02所产β-1,3-葡聚糖酶的酶学特性进行了研究。结果表明,该酶最适反应温度为55℃、最适反应pH值为5.0。Co~(2+)、K+、Zn~(2+)、Li~+、Ba~(2+)、Cu~(2+)以及1.0mmol/L的Fe~(2+)对该酶没有影响,Cd~(2+)和10.0mmol/L的Mg~(2+)对酶具有部分抑制作用,而低浓度的Hg~(2+)、5.0mmol/L以上的Mn~(2+)和10.0 mmol/L的Fe~(3+)能强烈抑制该酶的活性。该酶只能作用于β-1,3-糖苷键,以Larinami为底物时其米氏常数K_m值为128.34μg/mL,最大反应速度V_m为23.01μg/(min·mL)。经过SDS-PAGE测定的分子质量近似为80.137ku。     

裂褶菌-长枝木霉耦合发酵制备裂褶寡糖

裂褶菌多糖是一类具有β-1,6支链的β-1,3-葡聚糖,具有很好的抗肿瘤、益生元等多种生理活性,但其过大的分子质量和水不溶性影响其功能和应用。该研究以食品安全的长枝木霉为出发菌株,通过常压室温等离子体(atmospheric room temperature plasma, ARTP)诱变筛选后得到高产内切β-1,3-葡聚糖酶的突变株T-6,所产内切β-1,3-葡聚糖酶对热凝胶和茯苓多糖具有较好的水解能力。此外,对发酵得到的突变株T-6粗酶液进行了部分的酶学性质研究,结果表明内切β-1,3-葡聚糖酶的动力学参数K_m=4.005 g/L,最适反应pH和温度分别为6.0、50℃,在pH 5.0～6.5,45～60℃酶活力较高,相对酶活力在85%以上;有严格的底物专一性,只水解含β-1,3-键的热凝胶、茯苓多糖和小核菌多糖。将裂褶菌与突变株T-6进行混合培养,获得裂褶寡糖。结构分析表明该寡糖都是由葡萄糖组成,聚合度为4～15。另外,裂褶寡糖具有良好的DPPH和超氧阴离子(·O^-₂)清除能力。该研究通过真菌耦合发酵制备的裂褶寡糖...     

β-葡聚糖酶产生菌的选育及培养基初步优化

麦芽的皮层和胚乳糊粉层中都残存有内源酶无法完全降解的β-葡聚糖,进而影响浸出率和麦汁粘度、过滤难度和啤酒胶体稳定性。在啤酒生产中,添加外源β-葡聚糖酶可以有效解决这些问题。采用刚果红营养平板法(GCN平板法)从衡水老白干和老龙口酒曲中筛选了3株β-葡聚糖酶活力较高且生产周期短的菌株(分别标记为4#、8#、12#),通过液态发酵,测得酶活分别为0.362U/mL、0.542U/mL、0.511U/mL。并对发酵培养基进行了优化,得到8#初始菌株最佳酶活为0.556U/mL。对该菌株进行紫外诱变,得到突变株酶活为:0.879U/mL。     

~(12)C~(6+)辐照环境下酵母高产β-葡聚糖菌株筛选及条件优化研究

利用80 MeV/u能量的~(12)C~(6+)重离子束辐照处理面包酵母(Saccharomyces cerevisiae),经过发酵培养筛选,获得了9株高产β-葡聚糖的突变菌株,其中突变菌株YH-11的β-葡聚糖产量高达1.4833mg/mL,比出发菌株YS-00β-葡聚糖产量高73%。不同培养基条件碳源、氮源及金属离子浓度的改变对酵母菌β-葡聚糖产出能力影响的发酵实验表明,最佳培养条件是2%葡萄糖、1%牛肉膏,以及0.1%的KH_2PO_4和Mg_2SO_4,在此实验条件下,突变菌株YH-11的β-葡聚糖产量高达1.4833 mg/mL,较出发菌株YS-00产量提高了1.73倍。实验证明,重离子辐照技术是一种高效的微生物诱变育种手段,在未来的微生物发酵工业应用中具有广阔发展前景。     

淀粉液化芽孢杆菌5582产β-葡聚糖酶的发酵条件和酶学性质研究

报道了淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefacien)BS5582菌株产β-葡聚糖酶和蛋白酶的液体发酵条件优化和酶学特性的研究结果。摇瓶水平下产β-葡聚糖酶的最佳培养基(g/L)为大麦粉40,玉米粉30,豆饼粉30,Na2HPO4·12H2O6,(NH4)2SO44,MgSO·47H2O1,CaCl20.8;产酶最佳起始pH7.0,装液量25mL/250mL。种子于37℃培养10h后,接种量8%,在37℃下发酵51.75h后β-葡聚糖酶酶活最高达到182.52U/mL,蛋白酶酶活达8062U/mL。β-葡聚糖酶的最佳反应pH6.5,最佳反应温度50℃。10mmol/L的Ca2 、Na 、NH4 、K 、Mg2 对β-葡聚糖酶活性有一定的激活作用;而相同浓度的Cu2 、Fe2 则表现出较强的抑制作用。     

3种酶制剂对生产面包的体积影响

研究真菌木聚糖酶、β-葡聚糖酶对面粉粉质及拉伸性能的影响,并考察真菌α-淀粉酶、真菌木聚糖酶和β-葡聚糖酶3种单酶对面包的作用效果。通过正交试验确立20 mg/kg真菌α-淀粉酶、50mg/kg真菌木聚糖酶和50 mg/kgβ-葡聚糖为加工面包的最优化工艺条件。在上述条件下,面包平均体积为885 mL,该体积比不使用酶制剂的平均体积提高了17%。     

发酵大麦β-葡聚糖抑制秀丽隐杆线虫体内的脂肪沉积

本文研究植物乳杆菌发酵大麦β-葡聚糖(LFBG)和未发酵大麦β-葡聚糖(RBG)对秀丽隐杆线虫脂肪沉积的影响。在建立秀丽线虫肥胖模型的基础上,分别以不同浓度的LFBG和RBG处理线虫,通过油红O染色和荧光定量PCR法分析线虫体内脂肪含量变化及可能机制。LFBG和RBG中的β-葡聚糖含量分别达到71.70%和72.60%,其重均分子量(Mw)分别为3.14×10~4和1.66×10~5。LFBG和RBG均能显著提高线虫的运动行为能力,从而增加线虫的能量消耗,以减少线虫体内脂肪沉积,且在相同剂量时LFBG的抑制效果优于RBG。当浓度为25μg/mL、50μg/mL和100μg/mL时,与模型组相比,LFBG组的脂肪含量分别减少了15.83%、22.32%和35.67%,RBG组线虫在浓度为25μg/mL时无显著性变化,在浓度为50μg/mL,100μg/mL时脂肪含量分别减少了16.28%和22.29%。此外,LFBG能显著下调daf-16 mRNA的表达量,而RBG可上调cpt-1 mRNA的表达量。由此可见,LFBG和RBG可能通过不同作用途径来抑制线虫的脂肪沉积。     

FKS家族基因对酿酒酵母压力耐性的影响

FKS作为1,3-β-葡聚糖合成酶基因家族,对维持酿酒酵母细胞壁有重要作用。为探究FKS家族基因对酿酒酵母细胞抗逆性及其合成乙醇的影响,通过同源重组的方法分别构建了FKS1、FKS2和FKS3基因的缺失菌株,并比较重组菌株和原始菌株的性能差异。结果表明,FKS1缺陷菌株细胞壁的1,3-β-葡聚糖含量低于原始菌株60%,生长性能、抗胁迫性以及合成乙醇能力都较差。FKS3缺陷菌株的生长性能和胁迫性能与原菌株相似,在发酵环境中抵抗外界环境能力和合成乙醇能力优于原始菌株。因此,FKS1基因对维持酵母细胞活性和抗逆有重要作用,而FKS3基因对抗逆有负面作用。