结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌分泌蛋白指纹图谱的比较

目的比较结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分泌蛋白的指纹图谱,分析分泌蛋白表达的差异,为分枝杆菌的快速鉴别奠定基础。方法选取结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌标准菌株,培养后灭活,提取分泌蛋白,用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)检测菌株分泌蛋白的表达,Biomaker Wizard Software分析软件筛选差异蛋白。重复测定20次分枝杆菌分泌蛋白,评价SELDI-TOF-MS检测分枝杆菌分泌蛋白相对分子质量的重复性。结果AU芯片能捕获近30个分枝杆菌分泌蛋白峰,4个蛋白峰为分枝杆菌共有。与非结核分枝杆菌分泌蛋白指纹图谱比较,有1个蛋白峰为结核分枝杆菌所特有。SELDI-TOF-MS重复检测20次分枝杆菌分泌蛋白显示,同一蛋白峰的相对分子质量变异系数≤0.05%。结论结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌差异蛋白的发现,可能有助于分枝杆菌的鉴别。     

呼吸道合胞病毒F2蛋白与结核分枝杆菌早期分泌抗原靶6蛋白的融合表达及纯化

目的在大肠杆菌中融合表达呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F2蛋白与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)早期分泌抗原靶6(Early secretory antigenic target-6,ESAT-6)蛋白,并进行纯化。方法分别从MTB标准菌株H37Rv及含F蛋白全长基因的pMD18-T-f质粒中扩增esat-6-f2基因,插入原核表达载体pET-30a中,构建重组表达质粒pET-30a-esat-6-f2,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,经镍离子亲和层析柱纯化。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确;重组融合蛋白ESAT-6-F2相对分子质量约为21 000,主要以包涵体形式表达,可与小鼠抗His单克隆抗体特异性结合;纯化的融合蛋白纯度可达90%以上。结论成功在大肠杆菌中表达并纯化了重组融合蛋白ESAT-6-F2,为进一步研究其免疫原性和免疫保护性奠定了基础。     

人乳头瘤病毒58型截短型L1蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6的融合表达及其抗血清的制备

目的原核表达人乳头瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)58型截短型L1(Truncated L1,tL1)蛋白与结核分枝杆菌早期分泌型抗原靶蛋白-6(Early secreted antigenic target-6,ESAT-6)融合蛋白,并制备其抗血清。方法利用PCR技术分别从HPV基因组DNA和ESAT-6-18T质粒DNA中扩增tL1和ESAT-6基因,构建重组原核表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a,分别转化E.coli BL21(DE3)和Rosetta,IPTG诱导表达。表达的融合蛋白ESAT-6-tL1经镍离子亲和层析柱纯化后免疫昆明小鼠,ELISA检测血清抗体效价。结果 PCR扩增出750 bp的tL1基因片段和320 bp的ESAT-6基因片段,测序结果与GenBank登录的序列一致;重组表达质粒ESAT-6-tL1-pET-21a经双酶切鉴定,构建正确;表达的ESAT-6-tL1融合蛋白相对分子质量约40 000,在E.coli Rosetta中的表达形式为包涵体,纯化后纯度为85%,免疫小鼠血清抗体效价为1:4 000。结论成功表达了ESAT-6-tL1融合蛋白,并制备了其抗血清,为进一步研制检测HPV58的抗体奠定了基础。     

结核分枝杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6的原核表达及纯化

目的原核表达并纯化结核分枝杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6。方法将ESAT-6基因自pET-24b-ESAT-6质粒亚克隆至pGEX-3C载体中,构建重组表达质粒pGEX-ESAT-6,经酶切及测序鉴定正确后,分别转化大肠杆菌JM107和BL21(DE3),以不同浓度IPTG诱导表达,表达产物经GSH-Sepharose4 B亲和层析纯化。结果所构建的重组表达质粒pGEX-ESAT-6经酶切及测序鉴定正确;重组融合蛋白在大肠杆菌JM107中的表达量较高,可达菌体总蛋白的24.2%;最适IPTG诱导浓度为0.1mmol/L;纯化的目的蛋白纯度可达83.9%。结论已成功构建了重组表达质粒pGEX-ESAT-6,并在大肠杆菌JM107中高效表达,为结核分枝杆菌亚单位疫苗及核酸疫苗的研制提供了材料。     

γδT细胞及其治疗癌症的研究进展

γδT细胞属T细胞亚群,为一类不受组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)限制的先天淋巴细胞。γδT细胞能分泌大量细胞因子,参与体内多种生理及病理过程,在免疫监视及免疫防御等方面具有重要作用,可对癌细胞产生有效的细胞毒性反应。目前临床试验结果表明,γδT细胞在抗肿瘤方面展现出了良好的应用前景。本文就γδT细胞的分类、结构特征、作用机制、分离和活化方法及临床应用等方面作一综述。     

以结核分枝杆菌38kD重组蛋白为抗原的血清学诊断

目的克隆表达结核分枝杆菌38kD抗原基因,并以此蛋白为抗原,进行分枝杆菌的血清学诊断。方法采用PCR自结核分枝杆菌基因组DNA中扩增38kD抗原基因,经测序鉴定正确后,克隆于pGEX-4T-2表达载体,转化大肠杆菌BL21进行诱导表达,利用GSTrapFF蛋白柱纯化表达产物,经ELISA检测其抗原的灵敏度与特异性。结果目的蛋白表达量约占菌体总蛋白量的28%,ELISA检测灵敏度为79.8%,特异性为99.0%。结论重组38kD抗原可用于结核分枝杆菌的诊断。     

结核分枝杆菌分泌蛋白抗原免疫电化学检测方法的建立

目的建立一种新型、快速的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)分泌蛋白抗原85B(Ag85B)免疫电化学检测方法。方法先在玻碳电极(Glassy carbon electrode,GCE)表面电沉积一层纳米金,通过静电吸附固定普鲁士蓝壳聚糖(Chitosan-prussian blue,CS-PB)纳米复合物,利用壳聚糖的氨基功能团固定微米金磁微粒(Au-Fe3O4),再吸附兔抗Ag85B多克隆抗体,制得电流型免疫传感器。测定电极制备过程的电化学特征,通过原子力显微镜对免疫传感器进行表征,确定免疫传感器的最佳pH值、反应时间、检测线性响应范围及检测下限,验证该方法的特异性和重复性,并与ELISA检测结果进行比较。结果原子力显微镜结果表明,Au-Fe3O4与兔抗Ag85B多克隆抗体可连接到电极表面。在最佳pH值(pH7.5)和反应时间(12min)的条件下,该传感器响应的峰电流值与Ag85B浓度在10～500ng/ml的范围内呈良好的线性关系,检测下限可达10ng/ml,且具有良好的特异性和重复性。免疫传感器与ELISA检测结果的吻合性较好。结论已成功制备了检测Ag85B的免疫传感器,该传感器制备简单,操作便捷,灵敏度高。     

耻垢分枝杆菌与卡介苗作为载体在鼠结核病治疗中的作用比较

目的比较耻垢分枝杆菌(MS)与卡介苗(BCG)作为载体在鼠结核病治疗中的作用。方法分别以不同剂量的MS和BCG免疫BALB/c小鼠,观察二者的致病作用。以结核分枝杆菌H37Rv感染BALB/c小鼠4周后,分别用生理盐水、MS、GLS/IL-12、重组MS、BCG及GLS/IL-12重组BCG治疗6次,于第6次治疗后7d处死小鼠,检测肺、脾荷菌量、血清IL-12和IFN-γ水平、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的水平及肺、脾组织中颗粒溶素表达,并观察小鼠肺组织病理改变。结果重组MS和重组BCG组器官荷菌量明显低于MS和BCG组;重组MS和重组BCG组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于MS和BCG组,MS和BCG组明显高于生理盐水组;重组MS和重组BCG组脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的水平明显高于其他组;MS与BCG组比较,重组MS与重组BCG比较,荷菌量、病理变化、肺、脾中的IL-12和IFN-γ水平差异均无显著意义;淋巴细胞中的IFN-γ和TNF-α水平,MS与BCG组差异有显著意义,而重组MS与重组BCG组差异无显著意义;重组MS和重组BCG组在肺、脾中均有颗粒溶素表达;MS所致病变比相同剂量BCG轻。结论MS与BCG一样,可将要表达的基因靶向递送到相应的组织,并诱导特异性细胞免疫,同时其在体内的副作用低于BCG,因此可作为良好的有机载体。     

结核分枝杆菌早期分泌蛋白MPT64的原核表达及其在结核病血清学诊断上的初步应用

目的 原核表达、纯化结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)早期分泌蛋白MPT64,并初步评估其在结核病(tuberculosis,TB)血清学诊断中的价值.方法 PCR扩增Mtb标准菌株H37Rv mpt64基因,克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组质粒pET28a-mp...     

结核分枝杆菌Rv0057-Rv1352融合蛋白的制备及其初步应用

目的制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)Rv0057-Rv1352融合蛋白,并通过化学发光酶免疫法分析其抗原性,以评价其应用价值。方法根据Rv0057和Rv1352蛋白序列,合成Rv0057和Rv1352基因片段并进行扩增,分别插入质粒pET30aSETB中,构建重组质粒Rv0057/pET30aSETB和Rv1352/pET30aSETB。用NheⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒Rv1352/pET30aSETB,SpeⅠ和XhoⅠ双酶切重组质粒Rv0057/pET30aSETB,将回收的Rv1352基因片段插入Rv0057/pET30aSETB质粒中,构建重组质粒Rv0057-Rv1352/pET30aSETB,转化感受态大肠埃希菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达的包涵体蛋白经His.Bind蛋白纯化试剂盒纯化后,以其作为抗原建立化学发光酶免疫分析法,检测患者血清中抗结核抗体,并与市售M.tb抗体诊断试剂盒和痰涂片法进行比较。结果构建的重组质粒Rv0057-Rv1352/pET30aSETB的核苷酸序列与设计序列完全一致;表达的重组融合蛋白Rv0057-Rv1352相对分子质量约为30 500,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白的30%;纯化的重组融合蛋白的浓度为1.6 mg/ml,纯度为95%;以其为抗原建立的化学发光酶免疫分析法检测患者血清中抗结核抗体的灵敏度和特异性分别为66.70%和90.00%,而市售M.tb抗体诊断试剂盒的灵敏度和特异性分别为80.00%和63.33%;30例活动性肺结核患者经痰涂片检测,灵敏度为20.0%,化学发光酶免疫分析法检测灵敏度为66.7%,二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论成功制备了M.tb Rv0057-Rv1352融合蛋白,以其为抗原建立的化学发光酶免疫分析法检测抗结核抗体具有较高的灵敏度和特异性,在结核病血清学快速诊断方面具有广阔的应用前景。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与序列分析

目的:克隆并鉴定结核分枝杆菌ESAT-6基因。方法:笔者首先获得了结核分枝杆菌基因组,利用PCR的方法得到288bp的ESAT-6基因。连接到克隆质粒载体pGEM-T中,以大肠杆菌JM109作为受体菌转化,通过筛选克隆并提取质粒,利用酶切鉴定、PCR鉴定、以及序列,来证明重组质粒pGEM-T-ESAT-6中含有结核分枝杆菌ESAT-6基因。结果:成功克隆了结核分枝杆菌ESAT-6蛋白基因。     

结核分枝杆菌Rv3873抗原的同源表达及其在结核病血清学诊断中的应用

目的 在耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,Msm）中克隆并表达结核分枝杆菌（M. tuberculosis,Mtb）RD1区蛋白Rv3873,并评价其在结核病（tuberculosis,TB）血清学诊断中的价值。方法 以Mtb H37Rv标准株全基因组DNA为模板,扩增得到rv3873基因完整序列,克隆至分枝杆菌表达载体pMF406,构建重组质粒pMF406-rv3873,电转化至Msm mc2155,加入乙酰胺诱导表达Rv3873同源重组蛋白（mRv3873）,利用亲和层析进行纯化,Western blot分析抗原特异性;ELISA法检测27份TB患者和31份健康者血清IgG抗体,以大肠埃希菌表达的Rv3873(r Rv3873)和免疫优势抗原Ag85A作为对照抗原,评价mRv3873在TB血清学诊断中的作用。结果 在Msm中成功表达了重组Mtb蛋白mRv3873,主要以可溶形式存在,经Ni2+亲和层析柱纯化可获得高纯度（95%）的可溶性重组蛋白,蛋白浓度约为2.0 mg/mL;TB患者组血清中抗mRv3873和Ag85A抗原特异性IgG水平均显著高于健康...     

重组结核分枝杆菌11kDa蛋白皮肤试验与体外干扰素γ检测方法的比较

目的对重组结核分枝杆菌11k Da蛋白(以下简称重组11k Da蛋白)皮肤试验与体外干扰素γ(interferonγ,IFNγ)检测方法进行比较。方法选取32名健康志愿者进行重组11k Da蛋白和TB-PPD的同体双臂皮肤试验,分别于不同前臂皮内注射0.1 ml重组11k Da蛋白(10μg/ml)和0.1 ml TB-PPD(50 IU/ml),注射后24、48、72 h测量志愿者皮肤反应(硬结和红晕)的两个直径(最大径和最大径的垂直径),并取其均值。于皮肤试验前采集32名志愿者的静脉血,分离外周血单个核细胞,采用T-SPOT.TB试剂盒进行检测。比较重组11k Da蛋白皮肤试验与体外IFNγ检测结果的一致性。结果以注射72 h后的硬结反应统计重组11k Da蛋白皮肤试验中阳性人数为8名,阳性率为25%,TB-PPD皮肤试验中阳性人数为24名,阳性率为75%,其中强阳性人数为8名;体外IFNγ检测(T-SPOT.TB)阳性人数为7名,阳性率为22%。重组11k Da蛋白皮肤试验结果和体外IFNγ检测结果一致性良好(Fleiss Kappa值=0.913),这两种检测方法的阳性率远低于TB-PPD皮肤试验(Fleiss Kappa值=0.266)。结论重组11k Da蛋白皮肤试验的检测结果与体外IFNγ检测结果基本一致,有潜力成为结核分枝杆菌潜伏感染者的新筛查方法。     

人呼吸道合胞病毒与结核分枝杆菌融合蛋白TB10.4-F1的免疫原性

目的在大肠杆菌中表达并纯化人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的融合蛋白TB10.4-F1,检测其免疫原性。方法将重组工程菌TB10.4/pET28a/BL21和TB10.4-F1/pET30a/BL21经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析蛋白的表达形式;表达的融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1经His TrapTMHP层析柱进行亲和层析一步纯化后,免疫BALB/c小鼠。小鼠分为TB10.4(30μg/只)、TB10.4-F1(30μg/只)及PBS(200μl)组,分别于0、2、4周免疫小鼠,于每次免疫前1 d经尾部取血,分离血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性的IgG水平;于末次免疫2周后摘眼球取血,分离血清,ELISA法检测特异性IgG水平及中和抗体滴度。结果表达的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1的相对分子质量分别约13 300和59 600,均以包涵体形式表达,表达量分别占菌体总蛋白的53.9%和12%;纯化后的重组融合蛋白TB10.4和TB10.4-F1纯度分别可达95%和80%;与TB10.4组相比,TB10.4-F1组IgG水平明显升高,IgG1/IgG2a值明显降低,但仍大于1;TB10.4-F1组小鼠血清中RSV特异性中和抗体滴度可达log102.699。结论融合蛋白TB10.4-F1免疫原性强,能激发出较为平衡的Th1/Th2反应,并产生抗HRSV的中和抗体。融合蛋白TB10.4-F1有望成为预防HRSV感染的候选疫苗。     

结核分枝杆菌TB10.4与呼吸道合胞病毒F1蛋白的融合表达

目的在大肠杆菌中融合表达结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)TB10.4蛋白与呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)F1蛋白。方法从MTB标准菌株H37Rv全基因组中扩增TB10.4(N/X)和TB10.4(N/B)基因,分别插入原核表达载体pET-28a和pET-30a中,构建重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4(N/B)/pET-30a;从F/18T/DH5α菌株中扩增F1(B/X)基因,与TB10.4(N/B)/pET-30a质粒连接,构建重组表达质粒TB10.4-F1/pET-30a;将质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a分别转化感受态E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达;表达的重组蛋白进行Western blot鉴定。结果重组表达质粒TB10.4(N/X)/pET-28a和TB10.4-F1/pET-30a经双酶切及测序证明构建正确;表达的重组TB10.4和TB10.4-F1蛋白相对分子质量约为13 000和59 000,可与鼠抗His单抗特异性结合。结论成功在大肠杆菌中表达了重组融合蛋白TB10.4-F1,为进一步研究其免疫原性及保护性奠定了基础。     

结核分枝杆菌H_(37)Rv株Rv0341编码基因iniB的克隆与表达

目的克隆并表达编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因。方法利用PCR从结核分枝杆菌H37Rv株中扩增iniB基因,克隆于pET-22b(+)原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达及反应原性。结果克隆并表达了iniB基因,表达的蛋白相对分子质量约43000,诱导2h表达量较高,约为25%。目的蛋白主要以包涵体形式存在于超声沉淀中,纯化后蛋白纯度可达98%以上。经Western blot检测,纯化蛋白与依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)肺结核患者血清呈现强阳性反应,而与非依R菌肺结核患者血清不反应。结论已成功克隆并表达了编码结核分枝杆菌H37Rv株Rv0341蛋白的iniB基因,表达的重组蛋白具有反应原性及特异性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断方法的建立及试剂盒的研发奠定了基础。     

儿童急性淋巴细胞白血病CD34~+CD38~-群细胞在NOD/SCID与NSG小鼠体内增殖能力的比较

目的比较儿童急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)CD34+CD38-细胞群在非肥胖糖尿病(non obese diabetic,NOD)/重症联合免疫缺陷(severe combined immunodeficient,SCID)小鼠与在NOD/SCID基础上敲除IL-2Rγ链的小鼠(NOD scid gamma,NSG)体内的复制能力。方法采用免疫磁珠法分选ALL患儿骨髓CD34+CD38-细胞(作为阳性细胞)及其他各群细胞(CD34+CD38+、CD34-CD38-、CD34-CD38+,作为阴性对照细胞),经尾静脉分别注射于NOD/SCID或NSG小鼠体内,104个/只,连续监测小鼠的发病情况并记录小鼠生存时间;进行小鼠外周血白血病细胞计数及外周血、骨髓血涂片检查;将濒死小鼠处死后,取肝、脾组织,进行病理学检查。结果 CD34+CD38-细胞注射入小鼠体内后,NOD/SCID小鼠的存活期为56¹50 d,NSG小鼠的存活期为13150 d,NSG小鼠的存活期为13¹20 d;NOD/SCID小鼠外周血白细胞数量缓慢升高直至死亡或处死,NSG小鼠外周血白细胞数量从第7天开始升高,至75 d左右达高峰;NOD/SCID小鼠和NSG小鼠分别于注射CD34+CD38-细胞3周和2周后外周血涂片可见白血病细胞,NSG小鼠外周血涂片发现更多的蓝染幼稚细胞;NSG小鼠骨髓涂片中发现更多的圆形、外源整齐、蓝色深染的幼稚细胞;NSG小鼠脾脏组织中有明显的炎细胞团块,且组织疏松,NOD/SCID小鼠脾脏组织中未发现明显的炎细胞团块,且组织相对致密,两种小鼠的肝脏组织中均未发现明显的炎细胞团块和组织结构改变。结论 ALL CD34+C38-细胞在NOD/SCID小鼠及NSG小鼠体内均能增殖复制出白血病,NSG小鼠复制白血病的时间更短,恶性程度更高,且白血病的复制过程更接近人类白血病的病理过程。本实验为白血病发病机理的研究和临床用药的评价提供了更好的载体。