鼻腔喷雾型重组乙型肝炎疫苗中乙肝病毒表面抗原含量检测方法的建立及验证

目的建立鼻腔喷雾型重组乙型肝炎疫苗中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)含量检测方法,并进行验证。方法通过对壳聚糖酶的处理条件(反应温度、酶浓度和酶解时间)进行优化,建立鼻腔喷雾型重组乙肝疫苗中HBsAg含量检测方法,并对该方法进行特异性、线性范围、准确度、精密度(重复性、中间精密度)及耐用性验证。结果确定壳聚糖酶处理条件为:2 U/ml的壳聚糖酶于37℃水浴中孵育60 min,然后采用基于化学发光法的试剂盒定量检测HBsAg含量。壳聚糖酶的加入不会对疫苗中HBsAg含量检测产生干扰;HBsAg浓度在1.25~160 ng/ml之间与发光值具有良好的线性(r2≥0.95);高、中、低浓度疫苗的平均回收率分别为100.18%、103.54%和113.88%;重复性及中间精密度验证结果的变异系数(CV)均≤20%;壳聚糖酶浓度在1.5~2.5 U/ml之间以及酶解时间为60 min,测定值CV均符合≤20%的验证审定标准。结论建立了鼻腔喷雾型重组乙型肝炎疫苗中HBsAg含量检测方法,该方法具有良好的特异性、准确度、精密度及耐用性,可用于该疫苗的质量控制。     

转人HLA-A2基因小鼠对adr亚型重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)的免疫应答

目的对汉逊酵母表达的adr亚型重组乙型肝炎(简称乙肝)疫苗(adr疫苗)进行免疫学特性与功能学研究。方法采用adr疫苗与酿酒酵母表达的重组乙肝疫苗(adw疫苗)免疫转人HLA-A2基因小鼠,免疫剂量2μg/0.2 ml,于初免3周后进行第2次免疫。于第2次免疫1周后,采血,分离血清,经ELISA法检测小鼠血清中抗-HBs抗体水平。同时取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,采用HLA-A2/WLSLLVPFV五聚体荧光标记流式细胞术分析细胞中特异性抗乙肝病毒表位的CTL比例。结果 adr疫苗与adw疫苗均可诱导转基因小鼠产生抗乙肝表面抗原抗体,且抗体水平差异无统计学意义(P>0.05),2种疫苗对转基因小鼠的体液免疫应答的增强作用相似;adr疫苗诱导的乙肝表面抗原特异性CTL应答作用较adw疫苗更明显(P<0.05)。结论 adr重组乙肝疫苗(汉逊酵母)诱导转基因小鼠的体液免疫应答作用与现有adw疫苗相似,但其诱导机体产生细胞免疫应答的能力更显著,可能具有更加良好的预防HBV感染作用和前景。     

荧光染色法检测重组乙型肝炎疫苗中残留DNA含量

目的采用荧光染色法检测重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺中间产品、原液及半成品中残留DNA含量。方法采用《中国药典》三部(2010版)附录ⅨB荧光染色法检测重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺主要中间产品[丁基琼脂糖层析收集液(以下简称BA富集液)]、原液及半成品中残留DNA含量,对该方法的准确度、精密性进行验证,并用建立的方法检测10批BA富集液、原液及半成品中残留DNA含量。结果该方法线性范围1.25⁸0 ng/ml,r2≥0.999,最低检测限为1.25 ng/ml;DNA标准品在BA富集液、疫苗原液及半成品中的平均回收率分别为105.8%、101.4%和108.5%,准确度较好;不同时间点重复测定同一批样品的变异系数(CV)在1.6%80 ng/ml,r2≥0.999,最低检测限为1.25 ng/ml;DNA标准品在BA富集液、疫苗原液及半成品中的平均回收率分别为105.8%、101.4%和108.5%,准确度较好;不同时间点重复测定同一批样品的变异系数(CV)在1.6%⁶.56%之间,不同试验间重复测定同一批样品的CV在1.4%6.56%之间,不同试验间重复测定同一批样品的CV在1.4%³.6%之间,试验内和试验间精密性较好;10批BA富集液中DNA浓度均较高,经过纯化后,原液中DNA含量明显降低,半成品中除个别批号外,均基本达到低于10 ng/剂的要求。结论荧光染色法可用于重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)纯化工艺中间产品、原液及半成品中残留DNA含量的常规监测,具有简便、快速、自动化程度高等特点,测定前样品无需进行处理。     

重组酵母乙型肝炎疫苗质量分析

<正>我单位从美国默沙东制药公司引进重组酵母乙型肝炎疫苗工业化大规模生产技术和生产线，按《重组（酵母）乙型肝炎疫苗制造与检定规程》已生产140多批约1．5亿支、5ugHBsAg/支规格的重组酵母乙型肝炎疫苗。为确立该工艺所生产疫苗批内的均质性和批间的一致性，对各批疫苗各项质量指标的批间差异进行了分析。     

酿酒酵母残留蛋白ELISA定量检测方法的建立

目的建立酿酒酵母残留蛋白(Host cell protein,HCP)ELISA定量检测方法,为重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)及相关生物制品的质量控制提供依据。方法制备酿酒酵母全细胞蛋白参考品,以其为抗原,免疫家兔,采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗体,SDS-PAGE分析纯度,免疫双向扩散法测定抗体效价,Western blot法分析抗体的特异性。以制备的抗酿酒酵母多克隆抗体作为包被抗体,HRP标记的抗酿酒酵母多克隆抗体作为检测抗体,建立酿酒酵母抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法;梯度稀释酿酒酵母蛋白抗原参考品,并绘制标准曲线,确定该方法的线性范围及检测限,并进行特异性、准确度、精密度及适用性验证。结果共制备3批酿酒酵母抗原蛋白,其平均含量分别为1.61、1.64和1.63 mg/ml;纯化的IgG抗体纯度为91.7%,抗体效价为1∶64,能与酿酒酵母蛋白多数条带结合;酿酒酵母蛋白抗原浓度在6.25～200 ng/ml的范围内,线性关系良好(R2>0.99),最低检测限为6.25 ng/ml;用建立的方法检测小牛血清、人血白蛋白、MEM培养基、Vero细胞上清蛋白、Vero细胞乙型脑炎疫苗及PHK细胞狂犬疫苗,均无交叉反应,特异性良好;检测不同浓度的抗原回收率为97.6%～107.00%,变异系数均<10%,最低定量检测限为25 ng/ml;检测3批酿酒酵母重组乙型肝炎疫苗生产各工序中酿酒酵母蛋白的残留量,能有效反映杂蛋白去除率。结论成功建立了酿酒酵母HCP双抗体夹心ELISA定量检测方法,该方法特异性强,精密度及准确度良好,可用于生物制品中酿酒酵母HCP的检测。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品的研制

目的制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,用于重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力评价。方法选取检定合格的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)原液,经协作标定表面抗原蛋白含量后,加入氢氧化铝佐剂和冻干保护剂,冷冻干燥制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,并按《中国药典》三部(2010版)要求进行各项检定。经10次独立试验测定冻干参考品小鼠效力,采用Reed-Münch计算ED50值;将冻干参考品置4℃(8周)、37℃(4和8周)后分别检测疫苗效力,分析其稳定性,依据Q10法进行效期推测;并对2个生产企业10批疫苗进行效力测定,分析其适用性。结果制备的冻干参考品各项指标均符合规定,小鼠ED50均值为0.183μg,CV为50.5%;该CHO细胞效力冻干参考品蛋白含量定为20μg/ml,规格为10μg/0.5 ml;冻干保护剂、冻干工艺对乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力影响较小,冻干参考品在37℃放置不同时间,效力变化不明显,表明冻干参考品稳定性较好,有效期约为7年;10批疫苗中,不合格率为10%,表明该参考品可用于乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力质控。结论制备的冻干参考品可作为重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力检定的质控参考品。     

不含硫柳汞重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的免疫原性及稳定性

目的观察不含硫柳汞重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的免疫原性及其稳定性。方法配制12批不含硫柳汞的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞),观察其免疫原性及在4、22和37℃保存不同时间的稳定性。结果该疫苗各项检测指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求,实验组与对照组的效价测定结果差异无显著意义。10μg/ml疫苗22℃放置6个月和4℃放置12个月效力均未下降;20μg/ml疫苗在37℃放置4周后,效力略有下降。结论为婴幼儿提供了一种更加安全有效的重组乙型肝炎疫苗。     

氢氧化铝佐剂配制工艺的优化

目的优化氢氧化铝[A(lOH)3]佐剂配制工艺。方法对A(lOH)3配制工艺中的反应温度、氢氧化钠(NaOH)溶液的滴入速度、气体流量和反应终点pH值进行优化,观察配制的A(lOH)3溶液的状态。分别以原工艺和优化工艺配制的A(lOH)3溶液为佐剂制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞),比较二者的外观和效力。结果优化的A(lOH)3配制工艺为:反应温度70～72℃;NaOH溶液滴入速度185ml/min,10个点滴入;气体流量0.2bar;反应终点pH值5.80±0.05,以该工艺配制的A(lOH)3胶体颗粒大小均匀,呈淡淡的蓝白色,不发生沉淀。以优化工艺配制的A(lOH)3溶液为佐剂制备的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)无沉淀,为均匀的胶体,成品放置3年外观无显著变化;疫苗效力略有提高,但不显著。结论优化了A(lOH)3溶液佐剂的配制工艺。     

不同种类与剂量乙型肝炎疫苗在青年中的免疫效果及安全性

目的探讨不同种类与剂量乙型肝炎疫苗在青年中的免疫效果及安全性。方法在江西省上饶市卫生学校抽取乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)阴性、健康状况良好的15²0岁学生910名,随机分为A、B、C 3组,按照0、1、6月免疫程序,分别经上臂外侧三角肌全程接种3针10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)、20μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)和10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(酵母),全程免疫后1个月采集接种者静脉血,分离血清,采用放射免疫法检测抗-HBs水平,并进行安全性观察。结果全程免疫后1个月,A组与C组抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和分布相近,差异均无统计学意义(P>0.05);B组的抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和≥500 mIU/ml的分布均明显高于A组和C组(P均<0.01),抗-HBs GMC﹤10和1020岁学生910名,随机分为A、B、C 3组,按照0、1、6月免疫程序,分别经上臂外侧三角肌全程接种3针10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)、20μg/ml重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)和10μg/ml重组乙型肝炎疫苗(酵母),全程免疫后1个月采集接种者静脉血,分离血清,采用放射免疫法检测抗-HBs水平,并进行安全性观察。结果全程免疫后1个月,A组与C组抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和分布相近,差异均无统计学意义(P>0.05);B组的抗体阳转率、抗-HBs GMC水平和≥500 mIU/ml的分布均明显高于A组和C组(P均<0.01),抗-HBs GMC﹤10和10⁴99 mIU/ml的分布显著低于A组和C组(P<0.01或<0.001)。有1名接种者在接种后0.5 h有局部疼痛症状,第2天疼痛消失,未见其他局部及全身不良反应。结论接种高剂量乙肝疫苗的抗-HBs阳转率和抗-HBs GMC水平均高于低剂量乙肝疫苗,提示青年应接种高剂量乙肝疫苗,以建立有效的防御乙肝的免疫屏障。     

检测疫苗中小牛血清残存量ELISA试剂盒的研制

目的　建立一种简便、灵敏、特异、准确的疫苗中小牛血清残存量检测方法。方法　采用ELISA双抗体“夹心法” ,即固相载体上包被特异性抗小牛血清抗体 ,加入待测样品 ,反应后再加入酶标记抗小牛血清抗体 ,经显色后测定。结果　固相载体最适包被抗体的量为 1μg/孔 ,反应体系的pH为6 .8～ 7.2 ,两步反应的最佳时间各为 1h ,最适温度为 37℃。检测的最适抗原 (小牛血清 )范围为 2 0～ 10 0ng/ml,该试剂盒的灵敏度为 3ng/ml ,变异系数CV(n =2 8孔 /次 )平均为 5 .7%。经检测 6批疫苗的结果与放免结果相符合。结论　该法特异性强 ,灵敏度高 ,为疫苗中小牛血清残存量的检测提供了一种新方法