重组酵母乙型肝炎疫苗质量分析

<正>我单位从美国默沙东制药公司引进重组酵母乙型肝炎疫苗工业化大规模生产技术和生产线，按《重组（酵母）乙型肝炎疫苗制造与检定规程》已生产140多批约1．5亿支、5ugHBsAg/支规格的重组酵母乙型肝炎疫苗。为确立该工艺所生产疫苗批内的均质性和批间的一致性，对各批疫苗各项质量指标的批间差异进行了分析。     

重组(酵母)乙型肝炎疫苗接种母鸡的体液免疫应答

<正>近年来,对鸡抗体研究较多,现已证明用病原体免疫母鸡可诱发机体产生特异性抗体,但用重组酵母乙肝疫苗刺激母鸡诱发免疫应答的研究还未见报道。为此本实验采用重组酵母乙肝疫苗免疫母鸡,观察其血清特异性抗体变化及其诱发体液免疫应答水平及免疫应答持久性。 首次免疫用乙肝疫苗10μg/只鸡（美国海南鸡）加福氏完全佐剂,经背部皮下多点及鸡翅下注射,后用同剂量疫苗加福氏不完全佐剂加强,每次免疫间隔2～3周,共加强免疫4     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)免疫效果的观察

目的进一步观察重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的免疫效果。方法选择江苏省响水县某中心小学学生及教师,经筛查HBsAg、antiHBs和antiHBc均为阴性的98名作为观察对象,使用10μg重组乙肝疫苗(CHO细胞),按0、1、6个月3针免疫程序进行免疫效果观察。结果全程免疫后1个月,85名学生中,抗HBs阳性83名,阳转率为97.65%,GMT为172.50mIU/ml,最高可达498.12mIU/ml。男性、女性的抗HBs阳转率分别为97.50%和97.78%,GMT分别为170.11和148.42mIU/ml。结论10μg重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)应用于小学生,免疫效果良好。     

重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)上市后安全性的临床观察

目的 观察重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)上市后大规模应用于新生儿的安全性。方法 采用观察性队列研究方法,对2015年4月1日~8月30日期间在江苏省南通市辖区内新生儿按国家儿童免疫规划程序,常规接种重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母),分别通过《江苏省儿童预防接种个案信息管理系统》和《疑似预防接种异常反应(AEFI)信息管理系统》收集接种信息及接种后安全性数据,评价该疫苗应用于新生儿的安全性。结果 2015年4月1日~8月30日期间报告发生AEFI共37例,发生率为40.93/10万,无严重不良事件和严重非预期不良事件报告。37例AEFI病例中一般反应32例,异常反应5例,无偶合症与心因性反应报告;一般反应以接种后发热居多,占一般反应的67.57%,第3针接种后发热的发生率达69.84/10万;异常反应中过敏性皮疹2例,荨麻疹及热性惊厥各1例。37例AEFI病例不良反应主要出现在接种后30 min~24 h内,预后均良好。结论 重组乙型肝炎疫苗(酿酒酵母)上市后在新生儿中具有良好的安全性。     

ISCOMS重组乙型肝炎疫苗的研究

目的　提高CHO细胞表达的重组乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)的免疫原性。方法　采用透析法制备HBsAg免疫刺激复合物 (immunostimulatingcomplexes简称ISCOMS)。用放免法 (RIA)检测免疫小鼠的抗体滴度 ;标记胸腺嘧啶掺入法 (3H TdR)检测小鼠脾淋巴细胞转化率 ;CTLL 细胞株 XTT法检测IL 2活性。结果　经电镜观察ISCOMS颗粒呈蜂窝状 ,直径为 30～ 4 0nm左右。SDS PAGE分析 ,制备的ISCOMS颗粒HBsAg蛋白均由P2 3、GP2 7和GP30组成。用Bradfords法测定ISCOMS蛋白回收率为 4 1 5 0 %。免疫NIH小鼠结果显示ISCOMS重组乙肝疫苗和铝佐剂疫苗的ED50 分别为 10 3 2 2 5 5和 2 5 80 6 4 ;ISCOMS组的相对效力是铝佐剂组的 4倍。刺激指数 (SI)分别为 6 78± 2 32和 3 12± 0 5 4。IL 2水平分别是 10 2IU ml± 2 12IU ml和 4 95IU ml± 0 86IU ml。结论　ISCOMS重组乙型肝炎疫苗稳定性好 ,免疫原性强 ,抗体产生早 ,滴度高 ,并且能激起细胞免疫 ,有可能发展成为新一代疫苗。     

重组乙型肝炎疫苗工艺中去除甲醛添加的探讨

目的通过比较甲醛处理前后重组乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和疫苗(汉逊酵母)成品各项检测指标及稳定性的变化,评估甲醛在重组乙型肝炎疫苗工艺中的作用,为重组乙型肝炎疫苗工艺中是否可取消甲醛处理步骤提供参考。方法采用扫描电镜观察、HPLC检测和疫苗体内效力评价指标半数有效剂量(ED_(50))、乙肝疫苗常规检测项目比较甲醛处理前后HBsAg及疫苗成品的变化情况,通过稳定性考察确定甲醛对疫苗稳定性和有效期的影响。结果 HBsAg经甲醛处理后产生轻微聚合,但疫苗成品ED_(50)和其他各项检测指标均无明显变化,动物异常毒性合格。甲醛处理和未处理疫苗成品的稳定性考察结果相同。结论重组乙型肝炎疫苗生产工艺中甲醛处理步骤对疫苗成品检测指标及稳定性无影响,可考虑取消,从而提高乙肝疫苗的质量和安全性。     

重组腺病毒疫苗插入基因表达产物鉴别方法的建立及验证

目的 建立重组腺病毒疫苗插入基因表达产物的鉴别方法,并进行验证。方法 采用Western blot法对重组腺病毒感染后的细胞上清液进行检测,鉴别插入基因表达产物是否表达。对方法的专属性和耐用性进行验证,并采用该方法鉴别3批重组腺病毒疫苗样品插入基因表达产物的活性。结果 重组腺病毒疫苗插入基因表达产物能被黏蛋白1-生存素[mucin 1(MUC1)-Survivin]的两种抗体分别识别,在相对分子质量约37 000处可见特异性条带,大小和组成与实际值相符,方法的专属性和耐用性均符合要求。3批重组腺病毒疫苗插入基因表达产物也均能被MUC1-Survivin的两种抗体分别识别,在相对分子质量约37 000处可见特异性条带,而阴性对照不能被识别。结论 采用Western blot法检测插入基因表达产物的活性,专属性和耐用性均较好,适用于重组腺病毒疫苗产品的鉴别试验,可为疫苗制备过程中的质量控制及产品检定提供参考。     

不含硫柳汞重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的免疫原性及稳定性

目的观察不含硫柳汞重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的免疫原性及其稳定性。方法配制12批不含硫柳汞的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞),观察其免疫原性及在4、22和37℃保存不同时间的稳定性。结果该疫苗各项检测指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求,实验组与对照组的效价测定结果差异无显著意义。10μg/ml疫苗22℃放置6个月和4℃放置12个月效力均未下降;20μg/ml疫苗在37℃放置4周后,效力略有下降。结论为婴幼儿提供了一种更加安全有效的重组乙型肝炎疫苗。     

鼻腔喷雾型重组乙型肝炎疫苗中乙肝病毒表面抗原含量检测方法的建立及验证

目的建立鼻腔喷雾型重组乙型肝炎疫苗中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)含量检测方法,并进行验证。方法通过对壳聚糖酶的处理条件(反应温度、酶浓度和酶解时间)进行优化,建立鼻腔喷雾型重组乙肝疫苗中HBsAg含量检测方法,并对该方法进行特异性、线性范围、准确度、精密度(重复性、中间精密度)及耐用性验证。结果确定壳聚糖酶处理条件为:2 U/ml的壳聚糖酶于37℃水浴中孵育60 min,然后采用基于化学发光法的试剂盒定量检测HBsAg含量。壳聚糖酶的加入不会对疫苗中HBsAg含量检测产生干扰;HBsAg浓度在1.25~160 ng/ml之间与发光值具有良好的线性(r2≥0.95);高、中、低浓度疫苗的平均回收率分别为100.18%、103.54%和113.88%;重复性及中间精密度验证结果的变异系数(CV)均≤20%;壳聚糖酶浓度在1.5~2.5 U/ml之间以及酶解时间为60 min,测定值CV均符合≤20%的验证审定标准。结论建立了鼻腔喷雾型重组乙型肝炎疫苗中HBsAg含量检测方法,该方法具有良好的特异性、准确度、精密度及耐用性,可用于该疫苗的质量控制。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品的制备

目的制备冻干参考品,用于重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力检测。方法配制含氢氧化铝的保护剂,加入抗原至规定浓度,使各组分含量分别为明胶1%、蔗糖5%、氢氧化铝0.9mg/ml、抗原10μg/ml,分装冻干,制成冻干参考品,并对其理化指标进行全面检定。采用小鼠效力试验方法检测冻干对疫苗效力的影响,并比较冻干参考品与同批液体疫苗的稳定性。结果冻干参考品各项指标均符合规程要求,冻干前后疫苗效力无明显变化,冻干参考品与同批液体疫苗效力差异无显著意义,37℃热加速8周,冻干参考品效力未见显著下降,液体疫苗效力则明显下降。结论冻干对疫苗效力无影响,冻干参考品热稳定性良好。     

重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品的研制

目的制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,用于重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力评价。方法选取检定合格的重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)原液,经协作标定表面抗原蛋白含量后,加入氢氧化铝佐剂和冻干保护剂,冷冻干燥制备重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)冻干参考品,并按《中国药典》三部(2010版)要求进行各项检定。经10次独立试验测定冻干参考品小鼠效力,采用Reed-Münch计算ED50值;将冻干参考品置4℃(8周)、37℃(4和8周)后分别检测疫苗效力,分析其稳定性,依据Q10法进行效期推测;并对2个生产企业10批疫苗进行效力测定,分析其适用性。结果制备的冻干参考品各项指标均符合规定,小鼠ED50均值为0.183μg,CV为50.5%;该CHO细胞效力冻干参考品蛋白含量定为20μg/ml,规格为10μg/0.5 ml;冻干保护剂、冻干工艺对乙型肝炎疫苗(CHO细胞)的效力影响较小,冻干参考品在37℃放置不同时间,效力变化不明显,表明冻干参考品稳定性较好,有效期约为7年;10批疫苗中,不合格率为10%,表明该参考品可用于乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力质控。结论制备的冻干参考品可作为重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)效力检定的质控参考品。     

重组戊型肝炎疫苗的生殖毒性试验

目的探讨重组戊型肝炎疫苗对大鼠的生殖毒性。方法将Wistar雌性大鼠分为4组:低剂量组(每只20μg HEV)、高剂量组(每只40μg HEV)、生理盐水对照组及佐剂对照组,每组30只。雌鼠于交配前给药2次,初次给药后2周进行2次给药,2次给药后1周,进行雌雄鼠合笼交配,于妊娠7和14 d进行3、4次给药。每天观察雌鼠一般临床症状;交配前每周称雌鼠体重1次,交配后每周称体重2次,每周定期测定1次摄食量;于妊娠21 d安乐死孕鼠,分离出胎仔,检测疫苗对雌鼠生殖能力、胎仔发育、胎仔骨化程度、胎仔内脏畸形的影响,取孕鼠和胎仔血液,分离血清,ELISA法检测抗HEV Ig G抗体水平。结果各组大鼠精神状态未见异常,皮毛光亮,灵敏,大小便色正成形,注射局部未见充血、肿胀、溃烂、硬结等;疫苗对孕鼠体重、摄食量均无明显影响(P0.05);各剂量组窝平均着床数、窝平均黄体数、窝平均活胎数、受孕率、活胎率、吸收胎率、死胎率、畸胎率与生理盐水对照组和佐剂对照组相比,差异均无统计学意义(P0.05);各剂量组胎仔身长、尾长、体重、胎盘重和性别比与生理盐水对照组和佐剂对照组相比,差异均无统计学意义(P0.05);各剂量组胎仔上枕骨的骨化程度均在0级和Ⅰ级正常范围以内,胸骨骨化不全率与生理盐水及佐剂对照组相比,差异无统计学意义(P0.05);各组胎仔内脏均未见畸形;孕鼠及胎仔血清中均检测到抗HEV Ig G抗体。结论重组戊型肝炎疫苗对孕鼠及胎仔安全、有效。     

皮内注射用卡介苗特异性鉴别试验多重PCR检测方法的建立及验证

目的建立皮内注射用卡介苗(Bacillus Calmette Guerin vaccine,BCG)特异性鉴别试验的多重PCR法,并进行验证。方法根据GenBank登录的Pasteur 1173P2株序列(AM408590. 1)设计并合成引物,以制备的BCG特异性鉴别试验国家参考品(简称BCG鉴别参考品)DNA为模板,多重PCR法扩增其特异性缺失区RD1,产物经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定,验证方法的重复性、中间精密度、特异性、耐用性及灵敏度;采用该方法检测8批皮内注射用BCG供试品。结果 BCG鉴别参考品在重复检测6次、2名检测人员分别重复检测3 d、不同PCR退火温度及不同DNA聚合酶加量时均扩增出约200 bp的核酸片段;最低可检10 pg/mL的目的基因,仅对结核分枝杆菌H37Rv及皮内注射用BCG样品DNA扩增出特异性条带。经该方法检测,8批供试品PCR产物电泳均可见单一的目的条带,无RD1序列存在,大小与BCG鉴别参考品一致。结论多重PCR法的重复性、中间精密度、特异性、耐用性及灵敏度良好,可应用于皮内注射用BCG特异性鉴别试验。     

新型胃癌治疗性疫苗的细菌内毒素检查方法的建立

目的建立新型胃癌治疗性疫苗的细菌内毒素检查方法。方法依据《中国药典》三部(2015版)通则1143细菌内毒素检查法,使用细菌内毒素分散剂消除供试品的干扰作用,检测新型胃癌治疗性疫苗的细菌内毒素含量。结果新型胃癌治疗性疫苗在使用细菌内毒素分散剂稀释2倍后,对细菌内毒素实验无干扰作用,其细菌内毒素限值符合规定。结论所建立的方法可用于该新型胃癌治疗性疫苗的细菌内毒素检查,该方法对同类产品的细菌内毒素检查具有借鉴意义。     

氢氧化铝佐剂对重组乙型肝炎疫苗诱导的免疫相关细胞因子的影响

目的分析氢氧化铝佐剂对乙型肝炎表面抗原、重组乙型肝炎疫苗诱导的早期固有免疫反应和加强免疫后获得性免疫反应的影响。方法单针免疫,分为4组,每组15只:经BALB/c小鼠背部皮下注射重组乙型肝炎抗原(20μg/ml)、重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母,10μg/0.5 ml)、氢氧化铝佐剂(0.5 mg/ml),100μl/只,同时设生理盐水对照组,于免疫后3、24、48、96、168 h,收集处理外周全血及血清。加强免疫,分为2组,每组9只:相同方法免疫疫苗及抗原,1μg/(100μl·只),于初免后第14天,按照相同剂量加强免疫1次,于加强免疫后24、48、168 h,采集外周血分离血清。使用Luminex方法测定全血中相关因子的m RNA表达及血清中蛋白类细胞因子的分泌水平。结果单针免疫后24 h,3个免疫组多种细胞因子m RNA表达达到高峰,其中IRF7在铝佐剂和乙肝疫苗组中的表达显著高于乙肝抗原组(P0.05)。加强免疫后,乙肝疫苗组IL-5、IL-6和IL-12p70在24 h时分泌水平最高,之后逐渐下降;CXCL10、IFNγ和MIP-1α则随时间持续升高;乙肝抗原组中细胞因子分泌量及持续时间均低于乙肝疫苗组。结论氢氧化铝佐剂可单独或协同抗原,共同增强乙肝疫苗诱导的早期固有免疫反应,加强免疫后,铝佐剂促进多种细胞因子的分泌。     

短期异常低温对重组乙型肝炎疫苗效力相关因素的影响

目的模拟重组乙型肝炎(简称乙肝)疫苗在冷藏存储过程中发生的异常低温情况,探讨短期异常低温储存对乙肝疫苗效力相关因素的影响。方法选取3个不同表达系统(酿酒酵母、汉逊酵母、CHO细胞)来源的乙肝疫苗,分别于0、-7、-20℃储存1或7 d,检测疫苗的吸附完全性、上清中铝离子含量、效价和体外相对效力,比较乙肝疫苗经短期异常低温储存后与2～8℃正常储存条件下的差异。结果经短期异常低温储存后,疫苗的吸附完全性、疫苗上清中铝离子含量未发生变化;3种乙肝疫苗的ED50在0. 16～0. 68μg之间波动;汉逊酵母乙肝疫苗体外相对效力的变化幅度不超过10%,酿酒酵母乙肝疫苗在-20℃冻存7 d后相对效力较2～8℃储存下降21. 8%。结论短期异常低温储存后,乙肝疫苗仍能保持较好的吸附完全性,非胶体状态铝含量未发生变化,疫苗效价和体外相对效力在部分异常储存条件下出现下降,但仍符合质量标准要求。     

乙型肝炎疫苗纯化产物中脂质含量硫酸-香草醛测定法的建立及验证

目的建立乙型肝炎(简称乙肝)疫苗纯化产物中脂质含量的硫酸-香草醛测定法,并进行验证。方法以三油酸甘油酯为标准品,采用硫酸-香草醛法测定乙肝疫苗纯化产物的脂质含量,并对方法的线性范围、精密性、准确性进行验证,同时分析不同添加物对检测结果的影响。用该方法检测不同厂家乙肝疫苗纯化产物中的脂质含量。结果硫酸-香草醛法的线性范围为50~800μg/ml,回归方程为y=0.001 7 x+0.034 2,r=0.999 1;6次检测同批样品溶液脂质含量的变异系数(coefficient of variation,CV)为0.54%;2名操作人员检测3批样品溶液,重复测定3次的CV值为0.60%~3.26%;9份加标样品溶液的回收率为97.0%~105.4%;加入添加物Tween-20、PEG-6000、葡萄糖、甘油、Tris的样品回收率为92.4%~105.5%。不同厂家疫苗纯化产物每100μg蛋白脂质含量为53.9~309.5μg。结论本实验建立的硫酸-香草醛法具有良好的线性、精密性及准确性,可用于乙型肝炎疫苗纯化产物中脂质含量的测定。