共查询到16条相似文献,搜索用时 78 毫秒
1.
2.
3.
米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达 总被引:4,自引:0,他引:4
脂肪酶是主要工业用酶制剂之一,在食品、洗涤剂和制药等领域广泛应用。将编码米黑根毛霉(Rhizo-mucor miehei)脂肪酶RML的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML,载体经线性化后转化Pichia pastorisGS115,G418梯度筛选获得了分泌表达RML的重组毕赤酵母工程菌,SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致。初步研究表明,重组脂肪酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0,以橄榄油为底物时,发酵上清液酶活最大可达102 U/mL,表明构建的重组毕赤酵母工程菌具有较好的工业化生产潜力。 相似文献
4.
5.
以克氏担孢酵母V3脂肪酶基因为研究对象,构建毕赤酵母稳定的高效表达系统。采用同源克隆法从克氏担孢酵母V3中获得一个脂肪酶基因,并将其构建到表达载体pPICZαA,转入毕赤酵母X33中,成功实现了克氏担孢酵母V3脂肪酶基因在毕赤酵母X33中的表达。重组工程菌摇瓶培养120 h后,酶活力可达18 U/mL。重组酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为5.0。1 mmol/L的Mg2+、K+和Na+以及质量浓度为1 g/100 mL的曲通-100、吐温-80、吐温-20对重组KLIP具有激活作用。重组酶的最适底物为三硬脂酸甘油酯(C18)。 相似文献
6.
7.
研究毕赤酵母工程菌GS-LM-18产高温碱性脂肪酶的发酵培养基。通过单因素及正交试验对发酵培养基种类、初始pH及甲醇诱导浓度进行优化,并进行10L发酵罐放大培养研究。结果表明,在诱导温度为30℃,甲醇诱导浓度为1.0%时,最优发酵培养基配方为葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母浸粉1.5%,硫酸镁0.05%,磷酸二氢钾0.11%,磷酸氢二钾0.044%;发酵初始pH为8。按优化条件进行10L发酵罐放大培养,获得发酵液酶活高达2 749U/mL,是摇瓶发酵水平的3.9倍,蛋白含量为1.8mg/mL,OD600为290。该毕赤酵母工程菌发酵生产高温碱性脂肪酶,具有工业化生产的潜力。 相似文献
8.
9.
本研究组合了基因密码子优化及分子伴侣共表达策略提高碱性果胶酶(PGL)在毕赤酵母中的胞外产量。基于Pichia pastoris密码子偏好性,优化了来源于Bacillus sp.WSHB04-02 PGL高热稳定性突变体K314M基因,并克隆至pPIC9K的Eco R I-Not I得到PGL表达载体p PIC9K-PGL。p PIC9K-PGL转化Pichia pastoris GS115(his-)得到重组菌GS115/PGL 14#,胞外PGL酶活达到301.32 U/mL,较优化前提高25.1%。在此基础上,分别及同时共表达分子伴侣内质网蛋白折叠氧化还原辅助因子(ERO1)和泛素共轭酶(UBC1)。结果显示,同时表达ERO1和UBC1(GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#)使重组菌胞外PGL较共表达前提高49.3%,达到450.12 U/mL。应用指数流加策略对重组菌株GS115/PGLl-ERO1-UBC1 2#进行3 L罐发酵,诱导发酵96h胞外PGL可达1 362.31 U/mL。研究结果对促进PGL产量的提升及其应用具有重要现实意义。 相似文献
10.
11.
在50 L发酵罐水平对影响毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)发酵因素进行了研究。最适初始菌体密度(OD600)约为250,最佳诱导pH为6.0;降低诱导温度能有效提高单位甲醇转化率,诱导温度为20℃和25℃时的转化率分别是30℃的1.56倍和1.32倍。在以上最适条件下单位干菌体展示酶活及生产强度分别达275.0 U/g和462.5 U/(L.h),比优化前提高54.5%。研究发现,山梨醇和甲醇混合补料有效地提高了诱导前期(t=12h)的产酶效率,当山梨醇和甲醇混合比例为1∶4及1∶5是以甲醇为单一碳源时酶活力的1.7倍。 相似文献
12.
综合考虑密码子偏爱性、RNA稳定性以及自由能等因素,对疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)耐热脂肪酶(tll)基因序列进行密码子优化并全基因合成。将合成的tll基因连接到克隆载体,然后亚克隆到表达载体pHGWPT-tll,采用根癌农杆菌介导转化无孢黑曲霉SH-2。经过三丁酸甘油酯平板、SDS-PAGE以及Western Blotting鉴定,成功表达了tll基因。发酵72h,转化子脂肪酶酶活最高达36U/mL。转化子经等离子诱变得到的突变株的脂肪酶比活力比出发菌株提高约37%。 相似文献
13.
人对氧磷酶1(Human Paraoxonase 1,hPON1)是人体血液中的一种非专一性酯酶,可以水解多种有机磷化合物,被认为是一种有机磷农药中毒的解毒剂。为了得到较纯的具有活性的hPON1,本文采用巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris表达系统,对hPON1进行胞内表达。hPON1基因经过密码子优化后克隆至pPICZA表达载体上,构建得到pPICZA-PON1重组表达质粒,经线性化后转化至巴斯德毕赤酵母X33菌株中,筛选得到阳性重组菌株。将重组菌株进行摇瓶发酵120 h,酶活达0.15 U/mL。收集发酵液并细胞裂解后,用Ni-NTA螯合亲和层析的方法进行纯化,得到纯化的hPON1,SDS-PAGE结果显示表达产物的大小约37 ku,与预期的蛋白分子量相符。表达的重组hPON1的最适反应温度为45 ℃,最适pH为9.0。以上结果表明,本研究成功地表达并得到较纯的有活性的hPON1蛋白。 相似文献
14.
15.
本文通过RT-PCR从Coprinopsis cinerea okayama7#130中克隆得到laccase1,应用SignalP3.0Server软件分析其氨基酸序列后设计不含信号肽序列的新引物扩增得到不含信号肽的漆酶基因1(lac1),并构建重组酵母表达载体pPIC9K-lac1,电击转化毕赤酵母GS1115并用甲醇诱导表达,之后研究重组酶的酶学性质。克隆得到的laccase1全长为1593bp,编码530个氨基酸,其中信号肽包含18个氨基酸。SDS-PAGE显示重组蛋白大小约为65KDa。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为45℃,最适pH为4.3。重组漆酶在45℃保存3h后活性基本保持不变,在pH4.0~10.0的范围内稳定性较好。成功分泌表达的漆酶活力达到1.108U/mL。 相似文献
16.
裂殖壶菌甘油三酯合成和水解的过程中,脂肪酶起着重要的作用。根据同源性分析结果,筛选得到裂殖壶菌脂肪酶基因STGL2。以cDNA为模板获得STGL2脂肪酶基因,将其连接到pPIC9K载体上,得到重组质粒pPIC9K-STGL2,并在毕赤酵母中表达;系统分析了重组脂肪酶(Stgl2p)的底物特异性。结果表明:STGL2脂肪酶基因在毕赤酵母中成功表达;裂殖壶菌脂肪酶Stgl2p的最适底物为对硝基苯酚月桂酸酯(p-NPL),其最适p H为7.5,最适反应温度为35℃。综上所述,脂肪酶Stgl2p在裂殖壶菌细胞内对甘油三酯中长碳链脂肪酸的水解起着重要的作用。 相似文献