重组半胱氨酸脱巯基酶AtLCD的表达、纯化及酶学性质

目的:在重组大肠杆菌中表达重组拟南芥L-半胱氨酸脱巯基酶AtLCD(H2S内源产生关键酶),确定最佳诱导表达和纯化条件,并研究重组酶的酶学性质。方法:对大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-LCD进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,将纯化的目的蛋白AtLCD进行酶学性质的研究。结果:重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.1 mmol/L IPTG,30℃诱导3 h。500mmol/L的咪唑洗脱Ni柱可得较纯的目的蛋白。重组酶性质研究结果表明,酶的最适pH为9.5,最适作用温度为37℃,最适条件下的以L-Cys为底物的米氏常数(Km)为1.572 mmol/L,Vmax为1.52 nmol/mg·min。金属离子Mg2+,Fe3+和EDTA对重组酶的活性有一定的抑制作用,Ba2+、Ca2+和Co2+在一定程度上提高了酶的活性,其中Co2+效果更强。蛋白变性剂SDS和酶抑制剂羟胺也不同程度地抑制了酶的活性。结论:明确了重组AtLCD的酶学性质和最佳诱导表达及纯化条件,为该LCD的深入研究和气体信号分子H2S在植物应答逆境胁迫机制的研究奠定了基础。     

斑点叉尾鮰鱼肠蛋白酶的分离纯化及其酶学性质

以斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus鱼肠道为原料提取蛋白酶,对分离条件进行了优化,并对部分酶学性质进行了研究。结果表明:鱼肠内的蛋白酶在硫酸铵饱和度为70%时,所得沉淀中酶活力最高。经过阴离子交换层析分离后,蛋白酶的纯化倍数达到了218倍。该蛋白酶的最适温度为55℃,最适pH为7.5,具有良好的低温稳定性和酸碱稳定性,米氏常数为5.4 g/L。K+和Ca2+离子对该蛋白酶活性有较弱的激活作用,Mg2+则能显著激活蛋白酶活性;Na+和Zn2+对蛋白酶的活性有较弱抑制作用,而Cu2+和EDTA能显著抑制蛋白酶活性。     

棘孢木霉几丁质酶tachi2基因的原核表达及酶学性质研究

目的:实现棘孢木霉(Trichoderma asperellum)几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,研究几丁质酶Tachi2的酶学性质。方法:利用PCR技术扩增得到几丁质酶基因tachi2,将其克隆到原核表达载体pEHISTEV中,测序后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行Tachi2蛋白的纯化和复性。用纯化的目的蛋白Tachi2进行几丁质酶酶学性质的研究。结果:tachi2基因在重组大肠杆菌中正确表达,其主要以包涵体形式存在;重组蛋白Tachi2分子量约为44kDa,经过纯化和复性后得到的Tachi2有较高的几丁质酶活性。该酶的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,几丁质酶在40℃以下比较稳定、pH 6～9时酶有较高活性,受Cu2+和Zn2+的强烈抑制。结论:成功实现了棘孢木霉几丁质酶基因tachi2的原核高效表达,表达纯化了重组蛋白,明确了几丁质酶Tachi2的酶学性质,为该几丁质酶的进一步开发利用和深入研究奠定了基础。     

蟹源副溶血弧菌胞外蛋白酶的纯化与特性分析

采用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Cellulose离子交换柱层析等方法,从中华绒螯蟹Eriocheir sinensis弧菌病病原菌——副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus的胞外产物中分离纯化出两种具有致病作用的胞外蛋白酶。相对分子质量为39 600的蛋白酶是一种金属蛋白酶,EDTA可抑制其活性,金属离子Cu2+、Mg2+、Fe2+对该酶有抑制作用,而Ca2+对其则有一定程度的激活作用;该酶在50⁶0℃下热稳定性最好,最适pH为9。而相对分子质量为20 000的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶,EDTA对其酶活力几乎没有影响,但苯甲基磺酰氟(PMSF)可抑制其酶活性;该酶的最适温度为50℃,最适pH为8。     

膳食锌对饲料引起的大黄鱼铜中毒症的保护作用

试验检测大黄鱼幼鱼对饲料中铜和锌的吸收。4组试验膳食(分别为-Cu-Zn、-Cu+Zn、+Cu-Zn和+Cu+Zn)配制包括两种铜浓度(4和24 mg·kg~(-1))和两种锌浓度(0和120 mg·kg~(-1)),每组3个重复,试验共10周。高铜饲料组(+Cu-Zn和+Cu+Zn)大黄鱼的终体重、体增重较低,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和脂肪合成酶的活性均低于低铜饲料组(-Cu-Zn和-Cu+Zn),脂蛋白脂肪酶(LPL)活性也低于低铜饲料组,但高铜饲料组大黄鱼肝铜、肌铜和硫代巴比妥酸反应物(TBARS)含量较高。相比之下,高锌组(+Cu+Zn和-Cu+Zn)大黄鱼GPX活性高于低锌组(+Cu-Zn和-Cu-Zn),但高锌组TBARS含量和LPL活性低于低锌组。试验结果表明,铜摄入量高能减缓大黄鱼生长,抑制抗氧化酶和脂肪合成酶的活性。饲料中高浓度锌可缓解高铜对大黄鱼的毒性。     

一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶(Nm LEH)通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21 (DE3)宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0. 5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高(0. 45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组Nm LEH蛋白;对Nm LEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH为7. 5,在pH 7. 0～9. 0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明Nm LEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

地衣芽孢杆菌谷氨酰内切酶的克隆表达与性质研究

谷氨酰内切酶在食品行业应用广,但来源受限。以地衣芽孢杆菌ATCCl4580基因组DNA为模板,PCR扩增出670bp大小的谷氨酰内切酶基因,克隆入表达载体pET28a(+),转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白主要以包涵体形式存在。通过与硫氧还蛋白融合、降低诱导温度和共表达分子伴侣三种策略,以期增加重组蛋白可溶性,结果表明分子伴侣对可溶性有明显提高作用,而低温和硫氧还蛋白影响甚微。将重组蛋白样品与底物(Z-Phe-Leu-Glu-pNA)进行孵育反应,结果表明,该酶可有效水解谷氨酸残基的羧基,释放出4-硝基苯胺。酶学性质研究表明,此酶的最适反应温度为42℃,最适作用pH为8.0,金属离子Mn2+对酶活有较好的激活作用。     

海底沉积物中几丁质酶的筛选、分离及活性分析

目的:从海底沉积物中筛选得到一株几丁质酶活性较高的菌株,分离纯化菌株分泌的几丁质酶,并对其活性进行酶学分析。方法:以中国南海北部湾的沉积物为样本,结合透明圈法及DNS法筛选菌株。采用几丁质结合能力分析及多种层析方法分离纯化菌株分泌的几丁质酶,对其中一种几丁质酶进行酶学性质分析。结果:共筛选获得21株几丁质酶产生菌,其中分泌的几丁质酶活性最高的为蜡样芽孢杆菌B04(Bacillus cereus strain B04)。发现该菌共分泌6种含有几丁质结合域的蛋白。从蜡样芽孢杆菌B04发酵液中,分离纯化得到分子量为36 k Da的几丁质酶。研究发现,该酶是蜡样芽孢杆菌B04的一种主要的几丁质酶,其最适p H为4.0,最适反应温度为60℃,在p H 3.0~10.0范围内活性稳定,Co2+对其活力有明显促进作用,Ag+有显著的抑制作用。结论:为几丁质酶的工业化应用提供了基础。     

碳源和氮源对木蹄层孔菌产漆酶的影响及酶学性质研究

对不同碳源和氮源及碳氮比对木蹄层孔菌产漆酶的影响进行了研究,以提高漆酶产量,同时分析了该漆酶的酶学性质。漆酶合成的最适碳源是麦麸,最适氮源是蛋白胨,C∶N为10.4,优化后漆酶产量增加了约7.88倍;反应最适pH为3.0,最适反应温度为50℃,K m为0.20 mmol/L,V max为2.58 mmol/L·min;DTT 0.1mmol/L和NaN310mmol/L几乎能抑制漆酶全部活性,终浓度为10mmol/L的Ba2+,Ca2+,Co2+和Fe2+也几乎能抑制该酶的全部活性。该研究将为木蹄层孔菌漆酶的生产及在环境工程领域的应用提供基础信息。     

栖热菌噬菌体TSP4 dCTP脱氨酶基因的克隆表达

将编码栖热菌噬菌体TSP4菌株的dCTP脱氨酶tspdCD基因亚克隆到表达载体pET-32a中,并将重组质粒pET-32a-tspdCD转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,目的蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌Rosetta(DE3)中以可溶性形式高效表达。通过Ni-NTA agarose亲和层析柱纯化表达的tspdCD,并对其活性,最适作用温度、pH、底物特异性以及金属离子和有机溶剂对其活性的影响进行测定,检测结果表明重组蛋白活性达到4.12U/mg,它的最适作用温度和pH分别为60℃和7.5,最佳反应底物是dCTP,2mmol/L的Ca2+和Mg2+对其活性具有明显的促进作用,而同浓度的Ni2+和Cu2+对其活性产生了明显的抑制作用,10%(V/V)的乙酸乙酯和异丙醇对其活性有很明显的促进作用,而同体积比的丙酮对其活性产生明显的抑制作用。实现了tspdCD在大肠杆菌系统中的功能性表达,为进一步研究高温噬菌体tspdCD的功能奠定了基础。     

浅析符号学在泉州建筑中的运用

本文以符号学的角度 ,就如何从传统建筑中提取和吸收其建筑符号 ,进行现代地区主义建筑创作作一番探讨。     

织造遗韵楝亭歌--楝亭设计回眸

回顾总结了南京备受关注的文化建筑“江宁织造博物馆”中标志性建筑楝亭的创作思想,与整体建筑的关系以及单体结构与细部设计过程。通过楝亭的传统而独特的形式延续红楼梦大观园原型--江宁织造府的文化精神和遗产;通过创新的设计与体量、细部的推敲使其契合所在的场所与时代。     

三坊七巷保护性规划调查与建库关键技术探讨

本文着重阐述三坊七巷保护规划调查与建库中关键技术的应用,包括:调查内容设计、院落界线的确定、古民居房型的判断、古建筑构件质量界定的技术要点及数据采集、数据库的互访与关联、空间查询定位、空间数据分析、报表打印等关键技术的应用。     

试论孟子理想人格

对理想人格的追求与设计,是中国传统哲学长期探索的重要的人生课题之一。而儒家对人生哲学的探索,对中华民族的性格、民族精神的形成发挥着极其重要的作用。本文从孟子理想人格的要素、理想人格典范和理想人格修养三个方面探讨了儒家代表人物孟子的人生价值取向和理想人格境界。     

小型砌块房屋干缩变形裂缝的防治

分析了砌块砌体力学性能特点及砌块房屋裂缝的特点并且从房屋伸缩缝间距、砌块质量、施工管理等方面阐述了砌块房屋裂缝的防治。     

大学校园规划设计的新趋势

教育改革，对大学校园的规划设计提出了许多新要求，文章从功能，布局等诸多方面阐述和分析了大学校园规划设计的新趋势。     

The role of The Royal Academy of Engineering

The object of The Royal Academy of Engineering is the pursuit, encouragement and maintenance of excellence in the whole field of engineering to useful purpose in order to promote the advancement of the science, art and practice of engineering for the benefit of the public. The author discusses the Royal Charter, the educational influence of the Academy, overseas links, and its political influence     

建筑造型语言的同构

该文从心理学所剖析的联想到同构的角度出发,阐明了同构是设计师在进行形象恩维的过程中必不可少的环节,它能够帮助设计师创造出具有丰富内涵的造型视觉语言。同时,以较具代表意义的建筑师的作品为案例,分析同构在现代建筑造型语言中不可忽视的作用。     

广州雕塑公园规划设计

通过对广州雕塑公园的设计思想的阐述，分析探讨了以主体性雕塑为载体来展示城市发展进程的公园规划构思，强调运用现代化造园手法创造雕塑的意境美，空间美，在突出公园主题的前提下，营造不同的园林空间，追求雕塑与园林的相互依托与融合，同时在如何使主题公园在新的形势下适应游客的观赏水平方面做了有益的探索。