DNA条形码技术在深圳鱼肉制品鉴定中的应用

以线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ（COⅠ ）基因为目标基因,应用DNA条形码技术鉴别深圳批发市场和超市零售鱼肉制品的种类来源,判别其产品标签是否正确。本研究调查的77 份鱼肉制品均能扩增出特异性条带,28 份样品与产品标签标示不符,“错贴”率高达36.36%,其中所有标示“龙俐鱼”的商品都是低价的“巴丁鱼”（Pangasianodon hypophthalmus）。DNA条形码技术可用于鱼肉制品的来源物种鉴定。     

DNA条形码COI序列在常见肉类鉴别中的应用研究

为了对常见的4种肉类及相关肉制品进行掺假鉴定,判别与产品标签是否相符,本研究以COI基因为靶基因,建立了4种动物源性食品DNA条形码鉴别技术。分别提取牛、羊、猪、鸭四大物种的基因组DNA为模板,以其COI基因的保守序列区设计6对通用引物,结合文献报道及数据库提供的7对通用引物进行PCR扩增,并将测序结果提交Gen Bank数据库Blast比对,评价不同DNA条形码的检测鉴别能力。筛选出COI-A为最优序列,在4个物种中扩增效率100%。对抽检的20个批次的肉加工品样品进行检测,鉴定结果约有90%的样品与产品标签标示的成分相符。其中1个批次的牛丸制品因肉类成分含量低未扩增成功,1个批次的牛丸制品检出鸭源成分,判定掺假。DNA条形码技术快速有效,本研究筛选的COI-A序列可直接用于牛、羊、猪、鸭及其肉制品的鉴定,并为其它常见动物源性食品的种类鉴定提供一定参考依据。     

DNA条形码技术鉴别市售鱼肉制品真伪

以COΙ基因和16S r RNA基因作为鱼类制品通用的DNA条形码,对超市中采集的91份冷冻鱼肉样品及经过深加工的预包装鱼肉样品进行物种鉴定。结果表明:COΙ基因和16S r RNA基因均可用于鱼类制品物种真伪的鉴别;冷冻鱼肉样品和预包装鱼肉样品与其商标的符合率分别为83.54%和58.33%;市场中存在鱼类制品商品标签标示错误、配料标注不明确等问题,为相关部门对鱼类制品的监管提供了有力的技术支持。     

应用DNA条形码技术鉴定烤鱼片、鱼干中河鲀鱼鱼种

应用DNA条形码技术对北京和厦门市市售烤鱼片、鱼干中河鲀鱼成分进行鉴定。方法 以烤鱼片、鱼干中提取基因组DNA为模板,利用针对河鲀鱼细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的特异性引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆并测定线粒体COⅠ基因序列。将测序结果与GenBank中已有河鲀鱼的DNA序列进行BLAST比对,并且构建分子进化树。结果 本研究27份样品中有15份能扩增出特异性条带。通过BLAST比对和进化树分析,将15份样品归属到不同的河鲀鱼鱼种中。结论 北京和厦门市市售烤鱼片和鱼干中存在混入河鲀鱼的现象,应加强监管和规范产品的加工程序以避免中毒事件发生。     

实时荧光PCR法与环介导等温扩增法检测食品中动物源性成分的比较

目的比较实时荧光PCR(real-time PCR)法及环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测食品中动物源性成分,为食品安全监管部门动物源性成分鉴定提供准确、高效的检测方法。方法采用实时荧光PCR法及LAMP法分别对市售肉及其制品进行牛、猪和鸡源性成分鉴定,并与标签明示的肉源成分比对,以准确性和时效性2个指标对上述2个方法进行评价。结果 Real-time PCR法检出4份样品与标签明示肉源不符,LAMP法检出5份样品与标签明示肉源不符,而16份样品中仅有1份样品2种方法检测结果不同。Real-time PCR法检测用时1.5 h,提取检测用DNA用时1.5 h,总用时3 h;而LAMP法检测用时45 min,提取检测用DNA用时20 min,总用时65 min。结论 LAMP法与Real-time PCR均具有较好的特异性、准确性,但LAMP法耗时短、成本低、操作简单,便于现场快速监督抽检。     

基于DNA条形码技术对常见石首鱼科鱼胶的物种鉴定

摘　要：目的　运用DNA条形码技术对常见石首鱼鱼胶进行物种鉴定。方法　通过对26份鱼胶样品基因组DNA提取，PCR扩增COI基因、测序，用BOLD物种鉴定系统，与数据库中已有鱼类序列进行比对分析，鉴定出各鱼胶的物种；根据Kimura双参数模型计算样品序列遗传距离，并将所得序列构建NJ和MP系统发育树，进行聚类分析。结果　26份鱼胶样品通过鉴定引物“Fish-F”、“Fish-R”均可实现扩增，条带清晰单一，扩增和测序成功率均为100%；BOLD鉴定结果显示，26份鱼胶样品中23份能够确定物种来源（相似性达98%以上），包括石首鱼科12属15种鱼类，且多数为外来物种，另外3份鱼胶可推测其近缘物种。此外，系统发育树聚类分析结果与物种鉴定结果一致。结论　目前石首鱼类鱼胶来源物种较多，且多为外来基原鱼种。DNA条形码技术与BOLD鉴定系统相结合，可对大部分鱼胶进行准确的物种鉴定。     

鱼肉DNA提取方法比较及物种鉴定研究

本研究采用改进煮沸法(BP法)以及传统蛋白酶K法(TP法),从16种鱼肉样品中提取DNA,分析比对两种方法提取DNA的浓度、纯度、以及普通PCR和荧光PCR的效果。同时,运用BP法从70个市售鱼肉产品中提取总DNA,并采用DNA条形码技术进行物种鉴定。结果表明,BP法提取DNA耗时较短,对于大部分鱼肉样品,BP法提取的DNA浓度低于TP法,但两种方法提取的DNAA260/A280无显著差异,均满足普通PCR和荧光PCR扩增要求。另外,BP法提取的DNA可用于市售鱼肉产品DNA条形码鉴定,通过比对发现,81.43%的鱼肉产品可匹配到相似度≥98%的物种,在种水平和属水平的鉴定成功率分别为48.57%和72.86%。BP法在提取DNA过程中可缩短时间,降低提取成本,便于大批量样品的检测。     

应用DNA条形码技术对深圳市售花胶鱼种鉴定与分析

目的 采用基于DNA条形码技术对深圳市售花胶鱼种进行鉴定与分析。方法 以细胞色素C氧化酶Ⅰ(cytochrome c oxidase, COⅠ)基因为目标基因,应用DNA条形码技术鉴别深圳各药房和超市零售花胶的种类来源。结果 94份花胶样品均扩增出特异性条带。根据BOLD系统鉴定结果统计,深圳地区市售花胶94份样品中,按来源鱼种区分,基原鱼种(鉴定到属)为尼罗尖吻鲈和尖吻鲈属占比29.79%,其次为苏里南犬牙石首鱼占比15.96%,以及双棘原黄姑鱼/褐毛鲿占比8.5%。按来源鱼种所属的科区分,石首鱼科共计41个,占比43.62%;尖吻鲈科共计28个,占比29.79%;鳕科共计7个,占比7.45%。结论 目前我国花胶基原鱼种以石首鱼科为主,外来基原鱼种增多。深圳市售花胶存在真伪混淆现象,DNA条形码技术可用于花胶的来源物种鉴定。     

高通量二代测序基因条形码技术在动物源性制品物种鉴定中的应用

该研究利用二代测序和DNA条形码技术对生物制品中动物源性成分鉴定方法进行探索性研究。首先对常见的哺乳动物、禽类、鱼类物种以及多种混合样本进行了核酸提取,并利用PCR技术对其线粒体基因16S rRNA区域354 bp的检测位点进行扩增。使用Illumina Miseq二代测序技术获取所有序列信息,并与Gen Bank数据库比对分析样本中的物种组成。结果显示,混合样品中所有动物源性成分均得到正确鉴定;鹅和鸭核酸的最低检测下限为0.5ng/μL;市售商业化动物源性制品经检测发现2起标签不符问题。该检测方法在一个高通量测序和结果比对分析实验周期内,实现了混合DNA片段序列信息的一次性获取。检测结果准确,适用范围广,有望为动物制品标识符合性检查、打击走私等方面提供技术保障。     

DNA条形码技术在食用血制品掺杂成分鉴别中的应用

目的:建立一种可食用血制品中7种动物源成分(包括猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、兔)掺杂鉴别的分析方法。方法:血制品经DNA提取纯化及PCR扩增后,将克隆测序结果提交至7种血制品的DNA条形码本地数据库进行序列比对。对血制品的预处理方式、DNA提取方式以及PCR扩增条件进行选择和优化,并建立常见血制品掺杂模型,研究模型的最低掺杂检出率。结果:7种可食用血制品的DNA扩增效率为100%,各种掺杂模型中的最低掺杂检出率为5%;利用该法对25批次市售可食用血制品进行掺杂鉴定,发现有21批次存在掺有其他动物源成分的情况。结论:该方法简单、可靠,可作为日常可食用血制品质量监督的检测方法。     

Detection and identification of marine fish mislabeling in Guangzhou's supermarkets and sushi restaurants using DNA barcoding

In this study, DNA barcoding was applied to identify the distinct species of fish products in Guangzhou supermarkets and sushi restaurants in order to confirm whether products were correctly labeled. Samples were analyzed using mitochondrial cytochrome C oxidase subunit I (CO I) gene as the target. Our results showed that the CO I gene of all 139 samples examined was successfully amplified by PCR. When sequenced, 30 samples (21.58%) were mislabeled as the wrong species, 11 samples had insufficient information provided on the label to determine if the labeling was correct (7.91%), and four samples failed sequencing (2.88%). We also found that the use of proper labels for fish products in sushi restaurants was higher than that in supermarkets. As a simple, rapid, and efficient technology, DNA barcoding can be widely used for species identification of fish products. Our work shows that regulation of the labeling of fish products, as we evaluated in Guangzhou and other markets in China, is needed on a global scale.     

线粒体细胞色素b基因在鱼唇制品物种鉴定中适用性的研究

目的 探讨线粒体细胞色素b基因(cytochrome b, Cyt b)作为DNA条形码在鱼唇制品物种鉴定中的适用性。方法 对全国31个城市购买的252份鱼唇样品进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)测序,同源基因比较分析,构建系统发育树,鉴定制作鱼唇产品的鱼种,并对其进行濒危评价分析。结果 成功鉴定250个样品,一致性物种基因序列相似性在99%以上,涉及8个鲨鱼物种,最多样品为大青鲨(Prionace glauca),占样品65.5%,其余还有镰形真鲨(Carcharhinus falciformis)、路氏双髻鲨(Sphyrna lewini)、锤头双髻鲨(Sphyrna zygaena)等7类鲨鱼物种。结论 Cyt b可以作为对鲨鱼物种进行鉴定的一种DNA条形码,在对鲨鱼种鉴定时可以使用Cyt b基因及细胞色素氧化酶亚基I基因联合鉴定条形码,为深加工海产品物种鉴定提供更多的技术支撑。     

多基因DNA条形码鉴定6 个鳗鱼物种

建立6?种鳗鱼的物种多基因DNA条形码精准鉴定方法。以鳗鱼DNA为模板,采用3?对通用引物对6?种鳗鱼的3?个基因（16S rRNA、Cyt b、COⅠ）部分DNA片段进行聚合酶链式反应扩增、测序,结果6?种鳗鱼各获得3?条16S rDNA（638～643?bp）、Cyt?b（464～466?bp）、COⅠ（705～707?bp）基因部分DNA序列,从中选取各物种序列同源的片段设计3 对新引物对6 种鳗鱼的16S rRNA、Cyt b、COⅠ基因部分DNA片段进行PCR扩增,其产物大小分别为504～507、400、609?bp,再从各片段中筛选出具有6?种鳗鱼物种特异性强的、碱基数分别为262、280、300?bp的3?条DNA片段序列,作为6?种鳗鱼物种的3?个基因的标准DNA条形码,应用DNAMAN?V6软件进行同源性分析,并通过GenBank数据库的比对验证,制定了供检测实践用的同源率判别指标,建立鳗鱼物种的多基因条形码检测方法。应用该方法对30?个待检鳗鱼样品进行检测,结果表明,各样品基于3?个基因DNA条形码的比对,符合同源率指标,物种判别结果互相吻合,从而精准判别样品的所属物种。该方法稳定、精准、易于操作,可应用于6?种鳗鱼的物种鉴定,值得推广。     

应用聚合酶链式反应和限制性内切酶酶切技术鉴别鳕鱼

大西洋鳕鱼（Gadus morhua）作为一种具有高营养价值的海洋经济鱼类,常常会被掺入劣质、价格低廉的阿拉斯加狭鳕鱼（Theragra chalcogramma）或白姑鱼（Argyrosomus argentatus）等。通过对大西洋鳕鱼、阿拉斯加狭鳕鱼和白姑鱼的线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ,COⅠ）基因序列进行比对分析,分别设计特异性引物。结果表明：通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增得到大西洋鳕鱼和阿拉斯加狭鳕鱼COⅠ 基因扩增产物大小为579 bp,白姑鱼为399 bp;进一步使用BstE Ⅱ限制性内切酶对大西洋鳕鱼和阿拉斯加狭鳕鱼COⅠ 基因的PCR产物进行酶切,大西洋鳕鱼不能被酶切,而阿拉斯加狭鳕鱼被酶切为长度分别为361、218 bp的2 个片段,从而有效区分大西洋鳕鱼、阿拉斯加狭鳕鱼和白姑鱼。     

Universal mitochondrial 16s rRNA biomarker for mini-barcode to identify fish species in Malaysian fish products

Mislabelling in fish products is a highly significant emerging issue in world fish trade in terms of health and economic concerns. DNA barcoding is an efficient sequencing-based tool for detecting fish species substitution but due to DNA degradation, it is in many cases difficult to amplify PCR products of the full-length barcode marker (~650 bp), especially in severely processed products. In the present study, a pair of universal primers targeting a 198 bp sequence of the mitochondrial 16s rRNA gene was designed for identification of fish species in the processed fish products commonly consumed in Malaysia. The specificity of the universal primers was tested by both in-silico studies using bioinformatics software and through cross-reaction assessment by practical PCR experiments against the DNA from 38 fish species and 22 other non-target species (animals and plants) and found to be specific for all the tested fish species. To eliminate the possibility of any false-negative detection, eukaryotic endogenous control was used during specificity evaluation. The developed primer set was validated with various heat-treated (boiled, autoclaved and microwaved) fish samples and was found to show high stability under all processing conditions. The newly developed marker successfully identified 92% of the tested commercial fish products with 96–100% sequence similarities. This study reveals a considerable degree of species mislabelling (20.8%); 5 out of 24 fish products were found to be mislabelled. The new marker developed in this work is a reliable tool to identify fish species even in highly processed products and might be useful in detecting fish species substitution thus protecting consumers’ health and economic interests.     

Applicability of DNA barcode for identification of fish species

DNA barcoding is a species identification technique, which uses a very short DNA sequence from a region of approximately 650 base-pairs in the 5'-end of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I gene as a marker to identify species of mammals and fishes. The applicability of DNA barcoding for identification of fish species consumed in Japan was studied. Among thirty-one fresh or processed fishes were obtained from the market, two samples could not be identified due to lack of data in the Barcode of Life Data (BOLD) database. However, BLAST-search of 16S rRNA genes in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database and the PCR-RFLP method published by the Food and Agricultural Materials Inspection Center (FAMIC) were found to be applicable to identify these 2 fishes. The results show that the DNA barcoding technique is potentially useful as a tool for confirming the proper labeling of fish species in the Japanese market.     

新西兰柔鱼与北太平洋柔鱼的品种特异性聚合酶链式反应鉴定

利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增新西兰柔鱼和北太平洋柔鱼的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome C oxidase subunit Ⅰ,COⅠ）基因,通过多重序列比对检测2 种鱿鱼之间的多态性位点。根据2 种鱿鱼的特异性位点分别设计2 种鱿鱼的品种特异性引物,并利用多重PCR实现2 种鱿鱼品种的特异性鉴定和区分。结果表明：建立的品种特异性PCR鉴别体系对新西兰柔鱼和北太平洋柔鱼分别扩增出214 bp和339 bp的品种特异性条带,该方法的检测限低至0.1 ng,且能检测出新西兰柔鱼中1%的北太平洋柔鱼掺入,并能有效检测市场上2 种鱿鱼及其复配鱼糜制品的原料来源。