利用原生质体融合技术构建梨酒酵母工程菌

以菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae YDJ05及产香酵母Issatchenkia orientalis YS03为融合亲本X和Y,通过原生质体融合技术构建适合梨酒酿造的酵母工程菌,研究结果表明:利用EMS诱变亲本菌株Y,得到了一株精氨酸营养缺陷型菌株,亲本菌株X和Y采用蜗牛酶液在35℃下处理100min,得到菌株X、Y的原生质体融合率分别为93.6%、94.2%,再生率分别为27.8%、31.6%。以加热的方式灭活亲本菌株X,灭活时间为14min。在以PEG为促融剂的条件下对两株菌进行原生质体融合,经过优选得到融合子DJ02,其产酒精率、产香率等指标最优,分别达到了9.87%、0.37g/L。      

原生质体融合法构建增香型苹果酒酿造酵母的研究

以具有强发酵能力的酿酒酵母1605和产香能力好的苹果酒酵母E2为亲本,通过对原生质体融合条件的研究,得出以下结论:根据两亲本的生长曲线图确定两亲本在制备原生质体时的前培养时间为4h;在酶解温度35℃、蜗牛酶终质量分数为1%的条件下,最佳酶解时间为80min,此时,亲本菌株1605的原生质体形成率和再生率分别为92.4%和29.5%,亲本菌株E2的原生质体形成率和再生率分别为93.5%和30.7%;在60℃时,对亲本菌株1605的原生质体水浴灭活15min,即可完全抑制或钝化其原生质体活性。通过对融合子酿造苹果酒的感官和主要香气成分的分析,利用模糊综合评判法优选出8#菌株,该菌株具有产香能力好、发酵能力强的双亲优点,为优良的增香型苹果酒酵母菌株。     

酒精发酵酵母与产黄酮类色素酵母原生质体融合研究

以酒精发酵酵母K211和产黄酮类色素酵母PY-1两酵母菌株为亲本,进行双亲灭活原生质体融合育种实验;以期得到既带色素又有一定产酒力的酒精发酵酵母新菌株.另,过程中对于灭活参数进行初步优化,得到:85℃下对酵母菌K211灭活35min,85℃下对酵母菌PY-1灭活30min,为最佳条件.在融合子初步筛选过程中,通过感官评价进行反复比较筛选,最终得剑6株产酒、产色明显的融合子.通过发酵实验及传代培养,成功地分离出1株产酒力较高的融合子KP8-2.     

产番茄红素红酵母基因组重排实验条件的优化

目的:探索基因组重排技术应用于产番茄红素红酵母育种中关键步骤的最优条件.方法:本实验以3株产生番茄红素的红酵母ep-2-11、cp-2-6、cp-28为实验菌株,研究菌体培养时间、酶解浓度、酶解时间、灭活条件以及融合时间对基因组重排的影响.结果:当菌体培养12h,酶解浓度为2％,酶解70min时,原生质体制备与再生率最佳;15w紫外灯,照射距离为35cm,磁力搅拌50r/min的条件下照射18min,60℃下灭活35min作为双亲灭活条件;35％聚乙二醇4000(PEG-4000)作为融合剂,处理23min为最佳融合时间.结论:通过基因组重排最佳条件的确定,后续重排实验的效率得到很大的提升,最终筛选出了高产的目的菌株,产量较融合亲本提高了122％.     

微波-紫外灭活原生质体融合选育米曲霉菌株的研究

实验对生长速度较快但产酶能力较低的米曲霉CICC2339的原生质体采用700W微波灭活12s,对产酶能力较高但生长速度较慢的米曲霉AS3.951的原生质体采用15W紫外灭活5min,然后对灭活双亲用PEG作融合剂进行原生质体融合,融合率达到了7.6%。通过测定Hc值以及蛋白酶活力大小,最终筛选出编号为CAW202、CAW205和CAW210的三株融合株,其生长速度快且蛋白酶活力还高于产酶能力较高的亲本菌株CICC2339;三株融合株的蛋白酶活力分别为10450U/g、9730U/g、10780U/g,其中融合株CAW202和CAW210的蛋白酶活力比亲本菌株CICC2339有了显著的增加,分别提高了7.8%和11.25%。     

热-紫外灭活双亲原生质体融合选育米曲霉新菌株的研究

对米曲霉（AS3．951）GIM3．13和CICC2339的原生质体分别进行热灭活及紫外灭活,然后对灭活双亲用PEG（6000）作融合剂进行原生质体融合。融合实验最佳PEG（6000）浓度为35％,溶液pH值为7．5,融合率为4．24％。从融合子中选出17株生长速度快、菌落直径大的融合株,接种到酪素平板上测其Hc值,并与亲本菌株进行比较。结果发现,其中8株融合株的Hc值明显比生长速度快而产酶量低的亲本菌株GIM3．13大,菌株16号的Hc值还超过了产酶量高的亲本菌株CICC2339。     

原生质体融合构建直接转化淀粉生产燃料酒精的新型菌株

以K氏酵母、糖化酵母为亲本,采用单亲灭活原生质体融合技术进行属间融合,构建可直接转化淀粉产酒精的菌株。结果表明,取培养6～8 h的单倍体,在30℃下,用2.0%的蜗牛酶酶解1 h,均可获得高于92%的形成率及6.5%的再生率,制备好的原生质体经紫外线灭活糖化酵母后融合频率为7.3×10-6;最终获得一株性状稳定、酒精转化率高的融合子,在含5.0%的可溶性淀粉发酵液中,酒度可达7.0%(v/v)。     

产番茄红素红酵母基因组重排实验条件的优化

目的:探索基因组重排技术应用于产番茄红素红酵母育种中关键步骤的最优条件。方法:本实验以3株产生番茄红素的红酵母cp-2-11、cp-2-6、cp-28为实验菌株,研究菌体培养时间、酶解浓度、酶解时间、灭活条件以及融合时间对基因组重排的影响。结果:当菌体培养12h,酶解浓度为2%,酶解70min时,原生质体制备与再生率最佳;15W紫外灯,照射距离为35cm,磁力搅拌50r/min的条件下照射18min,60℃下灭活35min作为双亲灭活条件;35%聚乙二醇4000（PEG-4000）作为融合剂,处理23min为最佳融合时间。结论:通过基因组重排最佳条件的确定,后续重排实验的效率得到很大的提升,最终筛选出了高产的目的菌株,产量较融合亲本提高了122%。      

多亲本原生质体融合构建高产谷胱甘肽菌株

基于多亲本原生质体融合技术提高酿酒酵母Y518产谷胱甘肽能力。结果表明,酿酒酵母Y518培养8h,经0.15%巯基乙醇前处理,酶解(酶浓度17.5g/L)60min,原生质体形成率达90%以上;在40% PEG6000(含5g/LCaCl2)诱导下融合,融合率可达2.6×10-5;通过4轮基因组改组,得到2株GSH产量提高的突变菌株,最高可达15.92mg/g,为原始菌株的2倍。     

酵母属间融合构建直接转化淀粉生产燃料酒精的新型菌株

以糖化酵母和酿酒酵母为亲本，采用单亲灭活原生质体融合技术进行属间融合，同时对酵母原生质体形成和再生条件进行了探索，取培养6h-8h的单倍体在30℃下，2．0％的蜗牛酶酶解1．0h时，其形成率超过92％。并对双亲与融合子的细胞大小、DNA含量、淀粉利用率及产酒精能力等进行了比较研究；获得1株融合子，利用可溶性淀粉发酵，酒度可达6．5％（v／v）。