α2b—基因工程干扰素发酵培养基的优化

以LB和M9培养基为基本成分，运用均匀设计方法对α2b—基因工程干扰素发酵培养基的组成和配比进行了优化。所得适宜工程菌PBV321／BMH—71—18生长和rIFN—α2b表达的发酵培养基，经摇床培养，rIFN－α2b表达水平为5．0×105IU／ml培养液，分别是LB和LB＋M9培养基表达量的6倍和3倍。     

重组人肿瘤坏死因子α的分离纯化及鉴定

重组人肿瘤坏死因子α工程菌经发酵培养、破菌后,上清再经热处理、硫酸按分级沉淀,然后过SephadexG－25、DEANSepharoseCL-6B和Sephacry1S-100柱层析进行再纯化。结果显示,经多步层析纯化后rhTNFa回收率达27％,纯化倍数达236倍。连续纯化3批,纯度均达96％以上,比活性达3．9×106U／mg蛋白。提示所建立的纯化工艺稳定,为rhTNFα的基础研究和临床研究奠定了基础。     

聚乙二醇修饰重组人干扰素α1b的制备及其性质

目的制备聚乙二醇(PEG)修饰的重组人干扰素α1b(rhIFNα1b),并分析其部分性质。方法采用PEG修饰rhIFNα1b,通过离子交换层析分离纯化修饰混合物,单点修饰产物经超滤浓缩后,经Lowry法检测蛋白的浓度,SDS-PAGE和RP-HPLC检测蛋白的纯度,等电聚焦电泳检测蛋白的等电点,质谱法检测蛋白的相对分子质量,细胞病变抑制法检测蛋白的体外活性,ELISA法检测蛋白的抗原性。结果单点修饰产物的蛋白得率为33%;SDS-PAGE分析纯度为96.1%,RP-HPLC分析纯度为98.1%;等电点为6.22;相对分子质量为39946;比活为1.28×106IU/mg,活性保留率为14.4%;抗原性至少降至原来的1/625。结论制备的单点修饰rhIFNα1b药学性质获得改善,有望开发为安全、长效的新型干扰素。     

聚乙二醇化重组人干扰素α2b的质量检测

目的　建立聚乙二醇化重组人干扰素α2b(PEG rhIFNα2b)的质量检测方法。方法　采用Wish细胞 VSV病毒系统 ,以CPE法测定干扰素的生物学活性 ,基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测定相对分子质量 ,反向高效液相法 (RP HPLC)测定纯度 ,溴化氰裂解 SDS PAGE法测定肽图 ,等电聚焦电泳法测定等电点 ,紫外分光光度法测定紫外吸收光谱。结果　聚乙二醇化重组人干扰素α2b的比活为 6 . 0× 10 6～ 10 . 0× 10 6IU/mg蛋白 ,相对分子质量约为 6 2 6 0 0 ,等电点在 5 . 2 0～ 6. 5 5之间 ,紫外最大吸收峰约在 2 78nm波长处。结论　所建立的检测方法可控制聚乙二醇化重组人干扰素α2b质量。     

人α_1型干扰素单克隆抗体在纯化人α_1型基因工程干扰素的应用

作者采用本所研制的人α_1型干扰素单克隆抗体,将人α_1型基因工程干扰素纯化至电泳纯级,平均得率为93％,平均比活性为6.5×10~6 IU/mg蛋白,平均提纯倍数为15倍。3次试验经SDS-PAGF银染色法测定,均呈一条带,在非还原电泳条件下扫描干扰素纯度均在100％,残余鼠IgG含量测定均合乎规程要求,证明人α_1型单克隆抗体用于纯化人α_1型基因工程干扰素效果良好。     

突变型干扰素-τ的表达、纯化及其抗乙型肝炎病毒作用

目的在毕赤酵母中表达突变型干扰素-τ(IFN-τ),并检测其生物学活性及抗乙型肝炎病毒作用。方法将绵羊IFN-τ序列中6个氨基酸突变为人IFN-α相应的氨基酸,将合成的基因克隆至pPICZα质粒,构建突变型IFN-τ表达质粒pPICZα-IFN-τ,转化巴斯德毕赤酵母中进行高密度发酵。发酵上清液经超滤浓缩、离子交换层析和分子筛层析纯化后,检测其生物学活性及抗乙型肝炎病毒作用,并与市售IFN-α2a进行比较。结果发酵上清液中突变型IFN-τ的表达量为400～500mg/L,占上清总蛋白的40%以上;纯化收率达31.4%,纯度约为95%;比活为2.1×107IU/mg;对乙型肝炎病毒的抑制作用与IFN-α2a相当,但细胞毒性显著低于后者。结论已在毕赤酵母中高效表达了突变型IFN-τ,表达的蛋白具有较高的生物学活性,对乙型肝炎病毒有良好的抑制作用,且细胞毒性较低。     

重组人B7-H1IgV发酵纯化工艺的建立及其抑瘤活性

目的建立大规模生产重组人B7-H1IgV(rhB7-H1IgV)的发酵和纯化工艺,并检测纯化蛋白的抑瘤活性。方法对rhB7-H1IgV工程菌进行发酵培养,IPTG诱导表达,采用超声裂菌分离包涵体,梯度复性,2次Ni亲和层析等步骤纯化目的蛋白,并进行SDS-PAGE、Westernblot分析及抑瘤活性检测。结果在建立的发酵工艺下,rhB7-H1IgV的表达量可达菌体总蛋白的(10～11)%;纯化的rhB7-H1IgV蛋白经HPLC检测,纯度可达95%以上,Westernblot检测具有良好的反应原性;动物实验表明纯化的重组蛋白能诱导BALB/c小鼠产生高滴度的抗B7-H1抗体,且对肿瘤的生长具有明显的抑制作用。结论所建立的rhB7-H1IgV发酵纯化工艺简单迅速,为其开发和应用奠定了基础。     

注射用重组人干扰素β1b规模化分离纯化工艺的建立及其产品质量的检定

目的建立注射用重组人干扰素β1b(recombinant human interferonβ1b,rh IFNβ1b)规模化纯化工艺,并对该工艺制备产品的质量进行检定。方法采用高压均质机对rh IFNβ1b/BL21菌体进行破碎,离心提取包涵体,经有机抽提及酸化沉淀获得粗制rhIFNβ1b;通过Sephacryl S-200和Sephadex G-25层析纯化获得rhIFNβ1b原液,连续生产3批。将原液稀释,加入保护剂,经分装、冻干制备成品。同时对原液及成品的质量进行检定。结果 3批rhIFNβ1b原液蛋白产量可达6~7 g,平均回收率可达15.1%,平均效价为1.1×10~7 IU/mg,HPLC纯度和SDS-PAGE纯度均超过97%,一级序列和二级结构具有良好的一致性。每批rhIFNβ1b原液可制备出20 000~30 000支成品,且各项检定项目均合格。结论建立了rhIFNβ1b规模化分离纯化工艺,制品的产量、纯度及活性均较高,符合rhIFNβ1b工业化生产的要求。     

人干扰素α1b体外抗SARS-CoV-2 Omicron株的药效

目的 评价人干扰素(interferon,IFN)α1b体外抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)Omicron株的药效。方法 采用CCK-8法检测人IFNα1b原液、人IFNα1b滴眼液、人IFNα1b喷雾剂、瑞德西韦共4种药物的细胞毒性；qPCR法检测人IFNα1b对SARS-CoV-2 Omicron株(BA. 5/BA. 2/BA. 1)的抑制效果。结果 最高浓度(1×10⁷IU/mL)人IFNα1b原液和最高浓度(150μmol/L)瑞德西韦对Vero细胞未达到半数细胞毒性；人IFNα1b滴眼液和人IFNα1b喷雾剂的半数毒性浓度(CC₅₀)分别为29 958和37 550 IU/mL，对Vero细胞具有毒性。人IFNα1b提前孵育2 h后再攻毒，对BA. 1、BA. 2、BA. 5株的半数有效浓度(EC₅₀)分别为9.30、13.38、12.33 IU/mL，瑞德西韦分别为0.314 7、0.291...     

重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵及表达产物的纯化

目的建立重组戊型肝炎病毒抗原工程菌的发酵和目的蛋白纯化工艺。方法在三角烧瓶中,探讨不同的诱导剂浓度和培养基对菌体密度和目的蛋白表达量的影响;在10L发酵罐中,探讨诱导时间、补料方式、溶氧量对菌体密度和目的蛋白表达量的影响。根据目的蛋白的理化特性建立纯化工艺。结果重组HEV抗原工程菌在10L发酵罐分批补料培养中,采用0·1mmol/L的IPTG诱导4h,目的蛋白表达量约为25%,目的蛋白产率约为2·88g/L,且以包涵体形式存在。经过对包涵体粗纯、复性、纯化,SDS-PAGE分析,纯度可达95%以上。结论建立了周期短、产率高且稳定可靠的发酵及纯化工艺,为重组HEV抗原的大规模生产奠定了基础。     

应用高效液相色谱法定量检测重组人干扰素α1b

目的 寻找一种快速检测重组人干扰素α1b含量的方法。方法 采用美国Waters 600型高效液相色谱仪,选用Protein-Pak125 7.8mm×300mm柱,以25mmol/L pH7.0磷酸缓冲液为流动相,流速为1ml/min,检测吸收波长为280nm,以外标法按峰面积计算回收率。结果 平均回收率为95％,s=2.9％。结论 高效液相色谱法可以用于检测重组人干扰素α1b的含量,而且灵敏度高,结果准确。     

重组人干扰素α1b蛋白质含量HPLC检测方法的建立

目的建立测定重组人干扰素α1b(Recombinant human interferonα1b,rhIFNα1b)蛋白质含量的HPLC检测方法,并进行验证。方法应用HPLC外标法测定IFNα1b对照品的蛋白质含量,并对方法的线性及精密度进行验证。采用建立的HPLC外标法测定3批rhIFNα1b样品的蛋白质含量,并与Lowry法的检测结果进行比较。结果蛋白质在进样量5～50μg范围内,与峰面积呈良好的线性关系(r=0.998 1);用建立的方法重复进样6次,检测rhIFNα1b对照品溶液的蛋白质含量,相对标准偏差(RSD)为0.92%,<2%;用建立的方法检测0812001、0812003、0812006批rhIFNα1b样品溶液的蛋白质含量分别为0.465、0.503和0.496 mg/ml;HPLC外标法与Lowry法测定的蛋白质浓度有一定的差异,HPLC法的RSD<2%,Lowry法的RSD>4%,HPLC法的精密度较Lowry法好。结论建立了测定rhIFNα1b蛋白质含量的HPLC外标法,该方法操作简便,精密度较好,可用于IFNα1b原液蛋白质含量的检测。     

发酵温度对重组工程菌生长密度和干扰素表达的影响

目的 观察发酵温度对重组人干扰素α2a。（IFNα2a）工程菌PBV888/DH5α。生长密度和表达的影响。方法 采用NBS－40L发酵罐，在发酵过程中调整培养温度，检测工程菌的生长密度和IFN表达量。结果 经35℃培养至对数期，降温至30℃继续培养2－3h后升温至42℃进行诱导培养，连续实验3批次，平均生长密度A值为35．0，菌体湿重47g/L，IFN表达量为28×106IU/ml。结论 确立了工程菌生长和IFN表达的最适培养温度。     

干扰素α2b基因真核表达质粒的构建及表达

目的构建干扰素α2b(IFNα2b)基因真核表达质粒,并在CHO-dhfr-细胞中表达。方法从DH5α-pbv220-IFNα2b工程菌中扩增IFNα2b基因片段,克隆入psv-dhfr质粒中,构建重组真核表达质粒psv2-dhfr-IFNα2b,转染至CHO-dhfr-细胞中,经MTX加压筛选,获得稳定生长的单克隆细胞株。采用Wish细胞病变抑制法检测转染细胞中IFNα2b的抗病毒活性;提取细胞基因组DNA,进行PCR鉴定。结果重组真核表达质粒psv2-dhfr--IFNα2b经PCR及双酶切鉴定证明构建正确;转染后的重组细胞表达的IFNα2b具有抗病毒活性,且活性较强;以转染细胞基因组DNA为模板,可扩增出IFNα2b基因条带。结论已成功构建IFNα2b基因真核表达质粒,并在CHO-dhfr-细胞中表达了具有生物学活性的IFNα2b蛋白,为进一步对IFNα2b进行真核表达的研究奠定了基础。     

重组人干扰素β1b活性测定国家标准品的研制

目的研制重组人干扰素β1b(rhIFNβ1b)生物学活性测定国家标准品。方法按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhIFNβ1b标准品原液各项质量指标,以rhIFNβ1b国际标准品为标准进行协作标定,并检测其稳定性。结果rhIFNβ1b国家标准品经检测,外观、无菌试验合格,水分含量为0.8%,分装精度为0.44%。该标准品经3家实验室协作标定24次,几何平均生物学活性为7.18×104IU/支,平均生物学活性的95%可信区间为6.87×104～7.52×104IU/支,单次测定的95%参考值范围为5.76×104～8.68×104IU/支,平均可信限率为4.36%。在温度为-20、4、25和37℃条件下放置12个月,其生物学活性保持稳定。结论该批rhIFNβ1b活性测定国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,生物学活性定为7.2×104IU/支,批号为08/01。     

重组人骨形态发生蛋白-7工程菌的高密度发酵

目的建立重组人骨形态发生蛋白-7(rhBMP-7)工程菌的高密度发酵工艺。方法采用摇瓶及发酵罐培养工程菌BL21/pBV221-rhBMP-7,观察不同培养基、乙酸浓度、pH值、诱导时间等对工程菌菌体生长及目的蛋白表达的影响。在优化的发酵条件下培养工程菌,当菌体A600值达100时,42℃升温诱导,并对表达产物进行纯化。结果发酵培养基与LB培养基培养的工程菌目的蛋白的表达量无明显差异;乙酸可明显抑制菌体生长及目的蛋白表达;最适于菌体生长和目的蛋白表达的pH值分别为6.8和7.6;最佳诱导时间为3h。以优化的发酵条件培养的工程菌诱导3h后,目的蛋白的表达量可达菌体总蛋白的34.9%,最终菌体A600值可达139.5;经纯化的目的蛋白纯度可达95%以上。结论已初步建立了rhBMP-7工程菌的高密度发酵工艺。     

重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵及表达产物的纯化

目的 研究重组人碱性成纤维细胞生长因子工程菌高密度发酵和表达产物的纯化工艺。方法采用最适基质浓度、pH、溶氧量、培养温度等发酵表达条件及产物提纯方法。结果 菌体密度A6000达40.8,表达量达160mg/L。提纯的bFGF回收率为40％,生物学活性（ED50）为 0.21ng/mL,比活性达4.76×106U/mg,其纯度、分子量、残余DNA等各项检测结果均符合“重组 DNA制品质量控制要点”。结论 为hbFGF工业化生产和临床应用提供了依据。     

pRL-hTNF/JM103工程菌发酵和rhTNFα表达的研究

为便于下游中试规模生产,采用温度敏感型启动子PRPL构建rhTNFα工程菌,并对影响工程菌发酵培养和表达的因素进行了初步研究。结果显示,采用RTB培养基,50℃热水快速升温,诱导培养4～4．5h,湿菌体收获率和表达量均达到较高水平;50L发酵罐连续发酵3批,14000r／min连续离心,菌体收获率湿重达16．gg／L培养物,rhTNFα表达量占菌体总蛋白的10.5％,活性达1．35×107U／mg蛋白。.     

重组人干扰素α_(2b)工程菌的生物学特性检测

目的 观察和了解重组人干扰素α2b（以下简称rhIFN-α2b）工程菌的生物学性质,保证产品质量稳定。方法 通过对rhIFN-α2b工程菌的微生物学、分子生物学和免疫学检测,全面了解工程菌的性质。结果rhIFN-α2b工程菌呈现典型的大肠杆菌形态,在甘油中可以贮存1年,在冻干条件下可以保存2年,其生物学特性比较稳定。结论 rhIFN-α2b工程菌生物学特性稳定不变。     

重组α_(2b)型人干扰素工程菌菌种稳定性试验

重组α2b型人干扰素 (rIFN 2b)PBV889/JM10 3工程菌菌株传 10 0代后 ,经一系列检定表明 ,干扰素表达水平、质粒性状及其遗传稳定性、染色特性、菌落形态、电镜检查及其他理化特性均与原始菌种差异无显著意义 ,且无支原体及其他微生物污染 ,因此仍可作为生产用菌种