精制抗江浙蝮蛇毒血清与韩国三种蝮蛇毒的交叉中和作用

目的　考察本所精制抗江浙蝮蛇毒血清能否中和三种韩国蝮蛇毒及其中和能力。方法　用免疫双扩散法鉴定抗江浙蝮蛇毒血清与三种韩国蝮蛇毒交叉反应。并根据动物实验结果计算出每毫升抗血清中和三种韩国蝮蛇毒的致死毒及出血毒的量。结果　中国精制抗江浙蝮蛇毒血清 1.0ml可分别中和韩国黑眉蝮蛇毒、短尾蛇毒和乌苏里蝮蛇毒液态原毒的致死毒 1、3.9和 2 .5mg ;同时可分别中和上述 3种蛇毒蛋白 0 .8、3.15和 2 0mg中和出血毒。结论　中国精制抗江浙蝮蛇毒血清具有中和上述三种韩国蝮科蛇毒的作用。     

A、B、E、F型肉毒抗毒素的制备与检定

目的　制备马抗肉毒 (Botulinum)A、B、E、F型抗毒素。方法　菌种经过复苏分离与检定后 ,采用产毒培养、酸沉、盐析及脱毒等步骤 ,制备肉毒A、B、E、F四型类毒素 (Toxoid)和试验毒素 (Testtoxin) ,免疫健康马匹。结果　各型血浆效价均超过 2 0 0 0年版《中国生物制品规程》中对于抗毒素的要求 ,B型与F型的效价均超过 2倍以上 ,A型与E型也达到较好的应答水平。结论　已成功制备四型肉毒抗毒素。     

应用皮内多点攻毒法检测吸附精制白喉类毒素效价

将待检吸白类与参考标准品免疫动物后进行皮内攻毒,记录得分结果进行量反应平行线分析,其可靠性测验结果表明,剂间与回归项变异皆十分显著;偏离平行项、二次曲线、反二次曲线项以及试品间项变异皆不显著。这说明3批待检吸白类与参考标准品的剂量反应回归,是平行直线关系。所检定的3批吸白类效价分别为55.47、56.74和47.06IU/0.5ml,皆超过了WHO规程规定的30IU/0.5 ml的水平。以上事实说明,WHO所推荐的皮内多点攻毒法检测吸白类效价,方法是可靠的和敏感的。     

第三批吸附白喉类毒素国家标准品的制备和标定

目的建立第三批吸附白喉类毒素国家标准品,用于效价测定。方法选用白喉疫苗生产菌株(PW8,CMCC38007),经复苏传代和产毒培养后,收获白喉毒素,采用先精制后脱毒的方法获得精制白喉类毒素原液,再加入氢氧化铝吸附后分装冻干,作为备选品。按《中国药典》三部(2010版)要求对原液和冻干品进行检定。以WHO国际标准品(07/216)和中国国家标准品(002)为标准,采用小鼠Vero细胞法在3个实验室进行协作标定。结果该批标准品的各项检测指标均符合国家标准品的规定;经协作标定,获得的20个效价单位标定结果合并统计后几何均值为289.3 IU/ml,95%可信区间为276.0~303.2;同时用WHO国际标准品(07/216)和中国国家标准品(002)进行标定比较,两者差异无统计学意义(P0.05);标准品效价稳定性考核结果证明,我国白喉类毒素国家标准品在保存期内效价稳定。结论所制备的标准品各项指标均符合要求,其效价定为289.3 IU/支,可作为第三批吸附白喉类毒素国家标准品用于效价测定。     

江浙蝮蛇毒抗栓酶纯化方法的改进

用DEAE－SephadexA50离子交换层析结合亲和层析方法，从江浙蝮蛇（AgkistrodonhalysPallas）粗毒中分离纯化抗栓酶（EC3．4．21．28）。所得抗栓酶在SDS－PAGE上呈一条主区带及二条副区带，分子量在33～44KD之间，比活为14000USP单位／mg蛋白，回收率可达到60％以上，制品的出血毒及神经毒素均可合格，较本所原制备方法的纯度和得率分别提高10倍和4倍，且操作简单，适于大规模制备。     

一种抗人T淋巴细胞免疫球蛋白淋巴细胞毒效价检测方法的建立

目的 建立基于人白血病T细胞株Jurkat的抗人T淋巴细胞免疫球蛋白(anti-human T lymphocyte immunoglobulin,ALG)淋巴细胞毒效价定量检测方法,并进行验证。方法 采用人Jurkat细胞作为靶细胞,抗人T细胞兔免疫球蛋白(商品名：Grafalon)作为待检样品,建立其淋巴细胞毒效价定量检测方法。优化反应体系,考察细胞培养密度、细胞代次对待检样品效价的影响,并对方法的精密度进行验证。结果 优化的反应体系组成为50μL待检样品+50μL补体(1∶5稀释)+50μL细胞(5×10⁶个/mL);细胞传代密度为2×10⁵个/mL传代培养72 h或3×10⁵个/mL传代培养48 h用于效价测定最佳;当细胞生长状态较好且一致时,从P10到P25代次的细胞效价测定结果较一致。采用该方法板内重复测定待检样品效价,变异系数(CV)为6.32%,重复性良好;不同代次Jurkat细胞测定待检样品效价6次,CV为4.15%,中间精密度良好。结论 建立了一种便捷、精确的测定ALG淋巴细胞毒效价的定量检测方法,为...     

鼠神经生长因子国家标准品的研制

目的制备检测鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor,m NGF)效价的国家标准品。方法按照WHO相关要求进行m NGF国家标准品制备、分装、冻干及各项指标检测,以NGF国际标准品(Code93/556)为标准进行协作标定。结果 m NGF国家标准品原液纯度均达98.0%以上,其他理化及生物活性指标也均达到生物制品规程相关要求,冻干m NGF外观、无菌试验均合格,水分为0.9%,分装精度为0.49%,在-20、4、25和37℃放置6个月,其生物学活性保持稳定。该标准品经5家实验室协作标定共测定21次,平均效价为13 018 U/支,均值95%置信区间为12 408~13 657 U/支。结论该批m NGF国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,效价定为13 000 U/支。     

抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂的制备

目的制备检测抗狂犬病马血清效价的ELISA试剂。方法采用ELISA间接法。先用抗狂犬病病毒IgY包被酶标板,并确定其最适包被浓度;制备酶标二抗,并确定其最佳使用浓度。对试剂的灵敏度、特异性、精密性、稳定性及与小鼠中和试验结果的相关性进行考核。结果抗狂犬病病毒IgY和酶标二抗的最适浓度分别为10!g/ml和1∶1500,试剂灵敏度为0.072IU/ml,特异性良好,批间及试验间变异系数均小于11%,37℃放置3和5d检测样品结果与放置前差异无显著意义,与小鼠中和试验结果呈正相关。结论所制备的抗狂犬病马血清效价ELISA检测试剂盒,可用于抗狂犬病马血清效价的检测。     

不同工艺制备的E型肉毒毒素及其类毒素的免疫原性分析

目的用不同工艺制备E型肉毒毒素,脱毒制备类毒素,并分析其免疫原性。方法分别用菌体内提取法和酸沉淀法制备E型肉毒毒素,进行毒素型特异性检定及毒力测定后,脱毒制备类毒素,参考《中国药典》三部(2010版)进行结合价、蛋白氮(PN)含量、总氮(TN)含量、p H测定及脱毒检查和毒性逆转试验。选择结合价较高的2批类毒素配制3组抗原,经家兔皮下进行基础免疫(共2针)和3程超免疫(2针/程),每针间隔14 d,每程免疫间隔30 d,均于第2针免疫后第20天,经耳缘静脉采血,分离血清,参考《中国药典》三部(2010版)附录ⅪH肉毒抗毒素效价检测法,检测抗体效价。结果 55、120 h菌体内提取毒素(201112001和201112003批)及55、120 h酸沉淀提取毒素(201112002和201112004批)均为E型肉毒毒素,毒力分别为6.2×103、5.0×102、4.5×102、6.5×103 LD50/ml;各组类毒素脱毒检查和毒性逆转试验结果均符合《中国药典》三部(2010版)规定,55 h酸沉淀提取毒素其类毒素TN、PN含量最高,120 h菌体内提取毒素最低。制备的3组抗原(201112001-1、201112004-1及201112004-2批)抗原结合价分别为900、2 100和900 BU/ml;两种方法制备的类毒素按最高结合价配制抗原,免疫后的血清效价差异无统计学意义(P0.05),两种方法制备的类毒素按相同结合价配制抗原及同批类毒素配制的不同结合价抗原,免疫后的血清效价差异均有统计学意义(P0.05)。结论用酸沉淀法从120 h培养液中提取毒素可获得与55 h菌体内提取毒素相同免疫原性的类毒素。酸沉淀法操作简便,更适宜马匹免疫用E型肉毒抗原的规模化生产。     

人破伤风免疫球蛋白国家标准品的研制

目的　研制人破伤风免疫球蛋白国家标准品。方法　按WHO有关要求制备并检测标准品 ,以人破伤风免疫球蛋白国际标准品为标准进行协作标定。结果　冻干人破伤风免疫球蛋白国家标准品经外观、水分、无菌、分装误差、效力检测 ,均符合要求 ,在 4℃保持 6 0个月效力稳定。协作标定平均值为 10 5 5IU 支 ,CV值为4 7%。结论　该批人破伤风免疫球蛋白标准品可以作为国家标准品 ,效价定为 10IU 支 ,批号为 0 0 1     

不同破伤风抗毒素效价测定方法检测结果差异的分析

目的分析《中国药典》三部(2010版)及《越南药典》(2010版)方法测定破伤风抗毒素效价结果产生差异的原因。方法分别采用《中国药典》三部(2010版)及《越南药典》(2010版)规定的破伤风抗毒素效价检测方法(小鼠试验法),同步测定10批破伤风抗毒素供试品效价,比较结果差异;交换两种方法所用的稀释液,进行重复测定。结果两种方法测定结果差异有统计学意义(P<0.01),《中国药典》三部(2010版)方法测定结果比《越南药典》(2010版)方法高800~1 000 IU/ml;交换两种方法稀释液后,《中国药典》三部(2010版)方法供试组和对照组小鼠于注射48 h内全部死亡,《越南药典》(2010版)方法供试组和对照组小鼠于注射96 h后无发病症状,两种方法均不成立。结论《中国药典》三部(2010版)方法测定结果明显高于《越南药典》(2010版)方法,稀释液的不同是导致两种方法测定结果差异的原因之一。     

A型肉毒抗毒素的层析纯化

目的层析纯化A型肉毒抗毒素,提高免疫球蛋白F(ab′)2的纯度。方法采用阴离子交换层析纯化A型肉毒抗毒素,并通过试验设计(design of experiment,DoE)方法优化缓冲液的pH与电导。结果流穿液中的小分子杂蛋白含量受电导的影响较显著,并随着电导的降低而降低,而pH在试验设计范围内对其影响较小;聚集体/聚合体含量在低pH、高电导时含量较高,高pH、低电导时含量较低;F(ab′)2的纯度主要受电导的影响,并随着电导的升高而降低,在试验设计范围(2~20 ms/cm)内,F(ab′)2的纯度均在90%以上。结论采用阴离子交换层析可有效降低A型肉毒抗毒素中聚集体/聚合体以及部分小分子杂蛋白的含量,提高F(ab′)2的含量。     

蛇毒抗栓酶的质量分析

对从白眉蝮蛇毒、江浙蝮蛇毒和尖吻蝮蛇毒中提取的蛇毒抗栓酶制剂进行了酶活性和安全性分析。被检样品的精氨酸酯酶活性都能达到要求，有的还超过出厂规格的1～3倍，但类凝血酶活性定性试验只有68.1％（64／94批）呈阳性反应。出血毒性和神经毒性检测，有14．4％和38．5％的样品不能通过。用SDS－PAGE分析纯度，被检样品分别含3～7条区带，分子量最低14．6KD，最高87.6KD．说明目前国产蛇毒酶制品纯度和质量较差。     

破伤风抗毒素间接ELISA检测方法的建立及应用

目的建立检测破伤风抗毒素(TAT)效价的间接ELISA法,并进行初步应用。方法用方阵滴定法确定包被抗原和待检血清的最适工作浓度,并对各种反应条件进行优化,建立间接ELISA法。用建立的间接ELISA法检测3批TAT效价,并与小鼠中和试验法检测结果进行比较。结果建立的间接ELISA法的最适反应条件:抗原最适包被质量浓度为1.2μg/m L,血清最佳稀释浓度为400 m IU/m L;抗原与待检血清作用时间为45 min,加入酶标二抗后作用时间为60 min;抗原最适包被缓冲液为0.05 mol/L p H 9.6碳酸盐(CBS)缓冲液,4℃包被12 h;封闭液为30%BSA(5%蔗糖和5%乳糖);酶标二抗最适工作浓度为1∶8 000。3批TAT间接ELISA法效价检测结果与小鼠中和试验法效价检测结果相比,差异无统计学意义(P均0.05)。结论建立的间接ELISA法具有较高灵敏度,可用于TAT效价的检测。     

第一批赖氨酸升压素国家标准品的制备

目的制备第一批赖氨酸升压素国家标准品。方法以英国国家生物制品检定所(National Institute for Biological Standards and Control,NIBSC)提供的WHO第一批赖氨酸升压素国际标准品作为标准,选择4个实验室,采用《中国药典》二部(2010版)附录ⅫA升压素生物测定法对第一批赖氨酸升压素国家标准品待标品的生物效价进行协作标定,并比较二者的高效液相色谱(HPLC)主峰保留时间;按照《中国药典》二部(2010版)附录ⅧM水分测定法,第一法(费休氏法)B.库仑滴定法测定第一批赖氨酸升压素国家标准品待标品的水分含量。结果第一批赖氨酸升压素国家标准品待标品经协作标定,确定其生物效价为4.0 IU/支;其HPLC主峰保留时间与第一批赖氨酸升压素国际标准品一致;其水分含量为2.9%。结论本批待标品可作为第一批赖氨酸升压素国家标准品,以供赖氨酸升压素效价测定、鉴别及升压物质检查使用。     

静注巨细胞病毒人免疫球蛋白原料血浆的筛选及制备

目的筛选获得高效价血浆并制备静注巨细胞病毒人免疫球蛋白(intravenous immunogloblin against cytomegalovirus,CMV-IVIG)。方法分别使用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法及微量细胞中和法对113份人血浆巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)IgG抗体进行结合效价及中和效价的检测,将两种方法获得的高效价血浆分别制备CMV-IVIG,采用常规微量细胞中和法检测抗CMV中和效价,并与IVIG中和效价进行比较,确定符合要求的免疫球蛋白成品,确立血浆筛选方法。结果对113份血浆进行效价检测,将结合效价≥20 IU/mL以及中和效价≥1∶32的血浆分别收集并制备5%CMV-IVIG,成品批号分别20190401和20190402;20190401批CMV-IVIG成品中和效价为498.28 IU/mL,20190402批CMV-IVIG成品中和效价为2 357.56 IU/mL,而5%IVIG中和效价为259.53 IU/mL。结论 ELISA法筛选获得的血浆制备的CMV...     

中国标准百日咳菌苗效价的标定

中国标准百日咳菌苗#1#2系于1978年用百日咳I相菌CMCC 58004(型1、2、3)、CMCC 58031(型1、2)制备。该两批标准品曾用WHO标准百日咳菌苗#1、日本标准百日咳菌苗#28及英国百日咳菌苗参考制品#2为标准,对其效价进行了标化。1980～1981年又送至日本-N.I.H、美国F.D.A实验室核检,标化的结果经统计学分析,其效价每安瓶分别为16及21国际单位。反馈的信息证明,该标准品的质量及稳定性令人满意。     

人免疫球蛋白中甲肝抗体效价ELISA检测方法的建立及验证

目的建立人免疫球蛋白产品中甲肝抗体效价ELISA检测方法,并对该方法进行验证及初步应用,以期满足《中国药典》三部(2015版)对人免疫球蛋白产品中甲肝抗体效价的质量控制检测要求。方法将人免疫球蛋白甲肝抗体国际标准品(97/646)稀释后,采用建立的ELISA法检测甲肝抗体效价,分别验证方法的线性、准确性和精密度,试验均重复3次。应用建立的方法检测我国3家企业共13批人免疫球蛋白产品中的甲肝抗体效价。结果甲肝抗体效价在10~50 m IU/ml浓度范围内线性良好,相关系数为0.994 8;用建立的方法检测浓度为15、25、35 m IU/ml人免疫球蛋白甲肝抗体国际标准品的回收率在86.9%~104.4%之间,3次测定结果的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于10%。用建立的方法检测我国3家企业共13批人免疫球蛋白产品中的甲肝抗体效价,结果均低于《中国药典》三部(2015版)对甲肝抗体效价不低于100 IU/ml的新增要求。结论建立的ELISA方法快速、准确,可用于检测我国人免疫球蛋白产品的甲肝抗体效价。     

病毒灭活后抗淋巴细胞免疫球蛋白的稳定性

目的 观察经过病毒灭活后抗淋巴细胞免疫球蛋白(ALG)的稳定性。方法 取各项指标均符合国家暂行规程要求的ALGc放2-8℃保存,在不同时间进行质量测试。结果 24个月时,制品的花环抑制效价仍不低于1:4000,淋巴细胞毒效价不低于1:1 000。其纯度和IgG各组分含量与试验之前相比,差异无显著意义,且其他各项主要指标也均达到国家制检规程的标准。结论 经过病毒灭活后制品的稳定性良好。     

第九批人用狂犬病疫苗国家标准品的协作标定

目的 对制备的第九批候选人用狂犬病疫苗国家标准品的效价进行协作标定，并最终赋值。方法 组织人用狂犬病疫苗生产、研发等有资质的实验室，以第七批狂犬病疫苗国际标准品(NIBSC代码：16/204)为检测标准品，采用NIH法对候选狂犬病疫苗国家标准品进行效价测定。对协作标定单位的检测结果进行统计学分析，取有效检测值的几何均值作为候选标准品的最终效价值。根据国家药品标准物质制备的要求，对该候选标准品进行热加速破坏后检测糖蛋白抗原，考察其稳定性。结果 参加协作标定的单位有20家，剔除未严格按照协作标定SOP操作的2家，剩余协作单位数据均有效，经统计学分析，第九批狂犬病疫苗国家标准品效价最终赋值为11.4 IU/mL,95%可信限为10.9～11.9 IU/mL,ED₅₀的95%参考范围为2.10～2.75。37℃放置不同时间(2、4、8和16周)糖蛋白抗原检测结果未见明显差异。结论 完成了第九批候选人用狂犬病疫苗国家标准品(批号：201906001)的协作标定，其效价赋值科学、严谨、数据可靠，热稳定性符合要求。目前该标准品已获得国家药品标准物质委员会批准使用，对人用狂犬病疫...