重组破伤风毒素C片段的原核表达、纯化及其活性

目的原核表达、纯化重组破伤风毒素C片段(rTTC),并进行活性鉴定。方法采用PCR法从破伤风梭菌基因组DNA中扩增TTC基因片段,将其插入载体pThioHisA中,构建重组表达质粒rTTC-pThioHisA,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。表达的rTTC蛋白经离子交换、凝胶层析两步纯化后,采用Western blot、免疫双扩散及动物免疫试验进行活性及免疫原性鉴定。结果重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达的重组蛋白以包涵体和可溶性形式存在;纯化的重组蛋白纯度大于95%,能与全段破伤风毒素(TT)抗体反应,rTTC抗体能与全段TT反应。rTTC能较好地诱导家兔产生免疫反应,但诱导小鼠产生的免疫反应较弱。结论已原核表达并纯化了rTTC,其有望开发为一种新型抗破伤风芽孢梭菌疫苗及细菌多糖类结合疫苗的蛋白载体。     

P-糖蛋白基因疫苗的构建与鉴定

目的　制备P 糖蛋白基因疫苗。方法　利用PCR方法扩增编码人类P 糖蛋白多药耐药基因序列胞外区约 1kb片段 ,与真核表达载体pcDNA3进行定向重组 ,限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切反应及测序鉴定该重组基因疫苗 ,磷酸钙共沉淀法转染人类K5 62红白血病细胞 ,经G418筛选后 ,免疫组化分析该重组基因疫苗表达产物的抗原特异性。结果　构建了pcDNA3 MDR1重组基因疫苗。限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切分别显示 5 .4kb的载体片段及约 1kb的插入序列 ,测序 948个碱基中除 2个碱基突变外均与原序列排列相符。免疫组化方法证实细胞膜表面MDR1约 1kb片段的表达产物可被抗Pgp抗体识别。结论　构建的pcDNA3 MDR1重组基因疫苗可被市售的Pgp抗体特异性识别 ,具有Pgp抗原特异性     

产气荚膜梭菌β_2-β_1融合基因的构建及初步表达

目的构建产气荚膜梭菌β2-β1毒素融合基因并在重组大肠杆菌中表达。方法采用PCR方法,从含β2毒素基因质粒CPB2-9中扩增出β2毒素基因,经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后,回收0.73kb片段,再将含β1毒素基因质粒pXETB1经同样双酶切回收,与β2片段连接,转化BL21(DE3)中,进行诱导表达。结果经SDS-PAGE和Westernblot分析表明,重组菌株BL21(DE3)可表达β2-β1融合蛋白,且该蛋白可以被相应的抗体所识别。结论已成功构建了β2-β1融合基因,并在重组大肠杆菌中表达。     

破伤风毒素C片段的基因克隆、重组表达及免疫原性

应用PCR技术直接从破伤风芽孢杆菌质粒DNA中扩增出 1 4Kd的破伤风毒素C片段基因 ,经DNA序列测定证明其为破伤风片段C基因。将此基因克隆入大肠杆菌谷胱甘肽 S 巯基转移酶融合表达载体pGEX 4T 2 ,构建成重组表达质粒pGEX TC。经SDS PAGE蛋白电泳鉴定 ,表达产物为 76Kd的特异性重组蛋白。免疫印迹实验证实 ,重组蛋白抗原是破伤风C片段抗原。动物实验证明此重组抗原具有良好的免疫原性 ,1μg免疫剂量可使动物产生 1～ 2IU/ml的破伤风抗毒素 ,ELISA抗体滴度可达 1∶80 0。     

大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段的免疫原性分析

目的　分析大肠杆菌表达的破伤风毒素C片段 (简称TTC)的免疫原性。方法　利用分子生物学技术在大肠杆菌中表达破伤风毒素C片段 ,用阴离子交换层析和金属离子螯合亲和层析方法进行蛋白纯化。参照2 0 0 0年版《中国生物制品规程》的方法检测表达产物的效价。用间接血凝实验检测免疫动物血清中的破伤风抗体单位。结果　重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的 15 %。纯化后蛋白纯度达到 96 5 %。免疫效价为 18 70 6IU mg ,ED50 为 2 0 μg。 1μgTTC经 4次免疫能诱导机体产生足够的抗体 ,保护动物免受破伤风毒素的攻击。 结论　重组蛋白具有良好的免疫原性 ,为开发基因工程疫苗奠定了基础     

植物细胞表达人胰岛素的载体构建

目的构建人胰岛素的植物细胞表达载体。方法设计多对引物,通过PCR反应合成霍乱毒素B亚单位(CTB)基因和不带C肽的人胰岛素基因。将霍乱毒素B亚单位(CTB)基因与这种不带C肽的人胰岛素基因融合后,插入克隆载体,然后用BamHⅠ和SacⅠ进行酶切,并将酶切的融合基因片段连接在植物表达载体pBI121上,最后用BamHⅠ和SacⅠ进行酶切鉴定。结果测序结果表明,PCR扩增的目的基因顺序与设计完全一致,并构建了克隆载体和植物表达载体。植物表达载体经酶切后鉴定,所含基因片段大小与预期相符。结论已成功地构建了人胰岛素基因的植物细胞表达载体。     

柯萨奇B4病毒非结构蛋白P_2C基因的克隆与表达

目的克隆并表达柯萨奇B4病毒(CVB4)非结构蛋白P2C基因。方法提取CVB4总RNA,RT-PCR扩增P2C基因,克隆入pUCm-T载体中,进行酶切和测序鉴定。双酶切重组质粒pUCm-T-P2C,将P2C基因片段定向亚克隆至原核表达载体pMAL-C2中,转化大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果RT-PCR扩增得到987bp的基因片段,测序结果与GenBank公布的P2C基因序列一致。pMAL-C2-P2C经双酶切鉴定,证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约78000,表达量约占菌体总蛋白的25%,且具有良好的反应原性。结论已成功克隆并表达了CVB4P2C基因,为进一步研究其生物学活性奠定了基础。     

Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A-3C基因真核表达质粒。方法采集疫区牛的水疱液及水疱皮,经RT-PCR法扩增出Asia 1型FMDV的前体蛋白基因P1-2A片段和蛋白酶基因3C片段,分别克隆至pMD18-T载体上,通过酶切、连接,获得质粒pMD18-T-P1-2A-3C。经酶切获得P1-2A-3C片段,插入真核表达载体pVAXⅠpCMV启动子下游,构建pVAXⅠ-P1-2A-3C真核表达载体,用脂质体法转染HeLa细胞,进行IFA检测。结果Asia 1型FMDV真核表达载体pVAX1PⅠ-2A-3C,经酶切鉴定证明构建正确,转染HeLa细胞后,可见明显的黄绿色荧光,表明P1-2A-3C基因得到了表达。结论pVAXⅠ-P1-2A-3C可作为Asia1型FMD核酸疫苗的候选疫苗。     

百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得到rS1活性结构域编码片段。将其插入pQE-30载体中,转化大肠杆菌M15株,经IPTG诱导表达。表达产物经镍离子柱纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR及重叠延伸获得了约700bp的目的基因片段,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27000左右的蛋白,Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应。结论成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体,为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础。     

人巨细胞病毒gB基因真核表达载体的构建与鉴定

目的　克隆人巨细胞病毒 (HCMV)gB基因并构建真核表达载体。方法　根据Genebank中HCMV核苷酸序列设计引物 ,并在引物的 5′端分别加入BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶位点 ,特异性扩增gB编码基因片段。TA克隆后经双酶切、PCR、测序等鉴定重组质粒 ,再经双酶切、连接构建含HCMVgB编码基因的真核表达载体 ,转染COS7细胞 ,通过间接免疫荧光法 (IFA)检测该重组真核表达载体在COS7细胞中的表达。结果　重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成大小为 5 0kb与 2 7kb的片段 ,表明表达载体pcDNA3 1中插入了HCMVgB基因片段 ,测序结果表明读码框正确。重组表达载体pcDNA3 1 gB转染COS7细胞后 ,经IFA检测胞浆中可见黄绿色荧光。结论成功构建了pcDNA3 1 gB真核表达载体 ,并可在COS7细胞中表达     

肠道病毒71型3C基因原核表达质粒的构建表达及纯化

目的构建肠道病毒71型(Entervirus71,EV71)3C基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中进行表达并纯化。方法以病毒的反转录产物为模板,PCR扩增EV71 3C基因,克隆至pGEx-4T-1载体中,构建重组表达质粒pGEx-3C,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达的重组融合蛋白GSR-3C经GST-Agarose亲和层析和分子筛层析纯化后,Western blot检测其反应原性。结果重组表达质粒pGEx-3C经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组融合蛋白相对分子质量约46 000,表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶性形式表达;纯化后的重组融合蛋白纯度大于90%,可与小鼠抗EV71单克隆抗体特异性结合。结论成功构建了重组表达质粒pGEx-3C,在大肠杆菌中高效分泌表达并纯化了重组GST-3C融合蛋白,为EV713C蛋白酶结构与功能的研究及3C靶向药物和疫苗的研究奠定了基础。     

小鼠可溶性IL-5受体α胞外区基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达小鼠可溶性IL-5受体α(sIL-5Rα)胞外区基因。方法采用RT-PCR从BALB/c小鼠脾脏组织中分别扩增sIL-5Rα胞外区前后段基因片段,酶切后将两段基因连接,插入原核表达载体pPROEX中,构建重组表达质粒pPROEX/sIL-5Rα,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白的表达。结果重组表达质粒经双酶切和DNA测序,证实构建正确。表达的sIL-5Rα胞外区蛋白相对分子质量约36100,表达量约占菌体总蛋白的30%,且可与兔抗小鼠sIL-5Rα单抗发生特异性免疫反应。结论已成功克隆并原核表达了小鼠sIL-5Rα胞外区基因,为进一步探讨sIL-5Rα对哮喘的治疗作用及开发新的哮喘治疗药物奠定了基础。     

牛产气荚膜梭菌α-ε毒素基因的融合表达及其纯化

目的融合表达产气荚膜梭菌α毒素基因和ε毒素基因的融合基因α-ε,并进行纯化。方法利用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌C57-8株基因组DNA中扩增出α毒素基因的部分基因片段,插入到质粒p ET28a-ε上,构建含α-ε融合毒素基因的表达质粒p ET28a-α-ε,转化至E.coli BL21(DE3)plys S感受态细胞中,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,进行Western blot鉴定。结果重组质粒p ET28a-α-ε经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,与预期的基因序列重合率为99%。表达的重组蛋白相对分子质量约78 000,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的22.7%,纯度为91.2%,可与小鼠产气荚膜梭菌多抗血清特异性结合,具有良好的反应原性。结论成功构建了重组质粒p ET28a-α-ε,并在E.coli BL21(DE3)plys S中表达了重组α-ε融合蛋白,该蛋白具有良好的反应原性,可作为预防牛肠毒血症基因工程亚单位疫苗的候选抗原。     

破伤风毒素全基因片段PCR扩增、克隆和序列分析

目的 对破伤风毒素全基因片段扩增、克隆和测序,以便有效利用。方法 根据A、B、C3个片段的基因序列,分别设计上游和下游引物,采用PCR扩增,并克隆3个片段,进行序列测定。结果 所克隆的基因（AF389424）与GenBank中的基因序列比较变异较小,C片段基因与国内克隆株AF154828相同。结论 为进一步研究、利用奠定基础。     

狂犬病毒aG株核蛋白和糖蛋白双表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的构建狂犬病毒aG株核蛋白(NP)和糖蛋白(GP)双表达重组质粒,在中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)中表达核蛋白和糖蛋白。方法提取狂犬病毒RNA,应用RT-PCR方法扩增NP和GP基因,分别将其克隆到pIRES载体上,获得同时含有NP和GP基因的双顺反子重组质粒pING,并以脂质体介导法转染CHO-K1细胞,G418筛选,用ELISA和IFA检测NP和GP的表达。结果限制性内切酶分析表明重组质粒pING含有NP和GP基因片段,长度分别为1353bp和1575bp。应用ELISA和IFA方法,在转染细胞中均检测到NP和GP的表达。结论重组双表达质粒可在CHO细胞中同时表达NP和GP,为进一步开发重组狂犬病疫苗奠定了基础。     

破伤风毒素及其AB片段对金鱼的毒力

作者研究了破伤风毒素及其 AB 片段对金鱼和小鼠的毒力,发现16ng 的毒素即可使金鱼麻痹和死亡;26μg 的 AB 片段即可使小鼠麻痹和死亡,而对金鱼却无作用。当抗 C 或 AB 片段的抗体与毒素结合后,可阻断毒素对金鱼的致麻痹作用。上述结果表明,破伤风毒素可作用于金鱼的外周神经系统,而 AB 片段则不能。毒素与其受体结合是毒素对金鱼作用所必需的。     

小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1功能基因的克隆及原核表达

目的克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白。方法采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重叠PCR法扩增出692bp的OAZ1功能基因,重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,重组蛋白可在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。纯化的重组蛋白纯度可达79.96%,且可与抗His标签抗体特异性结合。结论已成功克隆了小鼠OAZ1功能基因,原核表达并纯化了重组OAZ1蛋白。     

人巨细胞病毒pp65基因片段的原核表达及鉴定

目的构建人巨细胞病毒(HCMV)pp65基因片段(363～505位氨基酸)的原核表达质粒,并鉴定所表达蛋白的反应原性。方法以含有HCMVpp65全长基因的pGEM-T-pp65质粒为模板,PCR扩增pp65基因第1087～1515位核苷酸片段,酶切后插入pET-21a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,纯化后进行Western blot鉴定。结果酶切分析和测序证明原核表达质粒pET-21a(+)-pp65构建正确。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,以1.0mmol/L IPTG诱导5h,目的蛋白的表达量最高。纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功构建了HCMV pp65基因片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了融合蛋白。     

人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因穿梭质粒的构建及表达

目的构建人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中进行表达。方法PCR扩增幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI编码基因全长片段,克隆入pET32a(+)质粒,鉴定正确后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pJHSP70,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70-UreI,转化耻垢分枝杆菌,诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出585bp的UreI基因片段。重组质粒pJHSP70-UreI经酶切和PCR鉴定,与预期结果一致。目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的18.5%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中获得表达。     

人IL-23R胞内区基因的克隆与原核表达

目的克隆人IL-23R(hIL-23R)胞内区基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。方法通过PCR获得hIL-23R基因的胞内区片段,克隆至载体pGEX-4T-1中,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-1-hIL-23R(I),转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Westernblot进行鉴定。结果hIL-23R胞内区基因的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析可见约760bp的目的片段。重组原核表达质粒经双酶切及测序证明构建正确。表达的融合蛋白相对分子质量约为55000,在低温(20℃)、低IPTG浓度(0.5mmol/L)诱导条件下能以可溶形式表达,可溶性蛋白的表达量约占菌体可溶性蛋白总量的16.1%,且可被兔抗GST多克隆抗体识别。结论已成功克隆了hIL-23R胞内区基因,并在大肠杆菌中表达了可溶性的GST融合蛋白。