硒化乳酸菌胞外多糖对体外培养小鼠脾淋巴细胞分泌NO、IL-4及IL-12的影响

目的:研究硒化乳酸菌胞外多糖对体外培养小鼠脾淋巴细胞分泌NO,IL-4及IL-12的影响。方法:分离制备了小鼠脾淋巴细胞,用Griess法检测NO含量,双抗体夹心酶联免疫法检测IL-4和IL-12含量。结果:当多糖质量浓度为400μg/mL时,硒化EPS对ConA刺激的T淋巴细胞NO分泌量高于EPS。培养4 h后上清液中NO浓度显著升高,培养8 h达到最高。硒化EPS可抑制小鼠脾淋巴细胞分泌IL-4,400μg/mL硒化EPS对于ConA刺激的小鼠T淋巴细胞IL-12生成量影响最为显著。结论:硒化EPS在一定程度上影响小鼠脾淋巴细胞免疫功能,这可能是其免疫调控机理之一。     

卵转铁蛋白对树突状细胞功能成熟的影响

目的：探究卵转铁蛋白（ovotransferrin,OVT）对树突状细胞（dendritic cells,DCs）功能成熟的影响。方法：通过混合淋巴反应检测OVT对DCs刺激T淋巴细胞增殖能力的影响,酶联免疫吸附分析（enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA）检测DCs上清液中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素12p70（interleukin-12p70,IL-12p70）和IL-10细胞因子含量,Western blotting检测胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated kinase,ERK）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）信号蛋白表达量。结果：OVT可以提高DCs刺激T淋巴细胞增殖的能力,并诱导DCs分泌TNF-α以及IL-12p70,且呈一定的剂量依赖关系。OVT可能是通过激活JNK和p38 MAPK信号通路以及抑制ERK信号通路上调细胞因子TNF-α、IL-12p70表达,从而促进DCs成熟。结论：OVT能促进DCs功能成熟,对机体的免疫具有调节作用。     

益生菌制剂对抗生素诱导腹泻模型小鼠肠道菌群的恢复

本论文采用肠上皮细胞模型HT-29细胞系研究8株植物乳杆菌在HT-29细胞上的黏附性,并研究黏附性较强的菌株及其胞外多糖（ExopolySaccharides,EPS）抑制大肠杆菌(E?coliATCC25922)在HT-29细胞上黏附及刺激HT-29细胞产生炎性因子的作用。结果表明8株植物乳杆菌在HT-29细胞上的黏附性差异较大：黏附性最强的植物乳杆菌35通过取代、竞争和排阻方式抑制大肠杆菌在HT-29细胞上黏附,抑制黏附率分别为30%、33%和59%,其EPS在作用浓度为500 μg/mL时对大肠杆菌的抑制黏附率为32%。植物乳杆菌35可抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8,通过取代、竞争、排阻方式抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8,抑制率分别为3%、28%和40%;其EPS抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8具有浓度效应,浓度为500 μg/mL时抑制率最高,为50%。而对于IL-10表达量的影响均不显著。结果表明植物乳杆菌35具有抑制大肠杆菌引起肠炎的潜在益生功能。     

植物乳杆菌35对大肠杆菌在肠上皮细胞HT-29上黏附及刺激产生促炎细胞因子的影响

本论文采用肠上皮细胞模型HT-29细胞系研究8株植物乳杆菌在HT-29细胞上的黏附性,并研究黏附性较强的菌株及其胞外多糖(Exopoly Saccharides,EPS)抑制大肠杆菌(E.coli ATCC25922)在HT-29细胞上黏附及刺激HT-29细胞产生炎性因子的作用。结果表明8株植物乳杆菌在HT-29细胞上的黏附性差异较大:黏附性最强的植物乳杆菌35通过取代、竞争和排阻方式抑制大肠杆菌在HT-29细胞上黏附,抑制黏附率分别为30%、33%和59%,其EPS在作用浓度为500μg/mL时对大肠杆菌的抑制黏附率为32%。植物乳杆菌35可抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8,通过取代、竞争、排阻方式抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8,抑制率分别为3%、28%和40%;其EPS抑制大肠杆菌刺激HT-29细胞产生IL-8具有浓度效应,浓度为500μg/mL时抑制率最高,为50%。而对于IL-10表达量的影响均不显著。结果表明植物乳杆菌35具有抑制大肠杆菌引起肠炎的潜在益生功能。     

植物乳杆菌胞外多糖发酵条件的优化

目的：对植物乳杆菌胞外多糖的发酵条件进行优化。方法：采用Plackett-Burman法从影响植物乳杆菌胞外多糖(EPS)产量的14个因素中筛选出3个主要影响因素,然后通过响应面法探讨最优工艺参数。结果：影响植物乳杆菌胞外多糖产量的主要因素是蔗糖质量浓度、接种量以及发酵温度,其最佳条件为蔗糖质量浓度34g/L、接种量5%、发酵温度31℃,在此条件下发酵的植物乳杆菌胞外多糖产量达425.16mg/L。结论：应用Plackett-Burman设计和响应面法进行植物乳杆菌胞外多糖发酵条件的优化是可行的。     

植物乳杆菌YW11生产胞外多糖的发酵条件研究

对实验室从西藏灵菇中筛选出的一株植物乳杆菌YW11发酵产胞外多糖的条件进行优化。首先通过单因素实验对发酵条件进行初步优化,然后利用二水平正交试验直观分析确定影响因素的主次顺序。以胞外多糖产量作为响应值,采用3因素3水平的响应面分析法,建立二次多项式回归方程的预测模型,从而确定植物乳杆菌YW11产胞外多糖的最优条件。单因素实验结果表明,发酵时间为18 h、碳源为乳糖(质量浓度为15 g/L)、氮源为大豆蛋白胨(质量浓度为15 g/L)、发酵温度为32℃、接种量为3%、p H值为6.0。直观分析确定影响植物乳杆菌YW11产胞外多糖主要发酵因素为大豆蛋白胨质量浓度、p H值、接种量,响应面法优化其较佳值为:大豆蛋白胨质量浓度为13.50 g/L,接种量为2.70%,p H值为6.27。验证实验表明,在优化的发酵条件下得到植物乳杆菌YW11胞外多糖产量为131.26 mg/L,与理论预测值(129.915 mg/L)相接近。     

一株融合菌株G23产胞外多糖的流变学特性

融合菌株G23是由植物乳杆菌C88和发酵乳杆菌F6通过原生质体融合获得的菌株.采用动态流变仪,在不同多糖质量浓度、温度、pH值务件下测定融合菌株G23所产生的胞外多糖的流变学性质.所产胞外多糖溶液是典型的非牛顿流体,胞外多糖质量浓度的增大可提高溶液体系的黏度.在10～80℃的较大温度范围内黏度变化较小,在所测温度范围内溶液黏度基本保持不变.在不同pH值条件下,胞外多糖溶液均表现为剪切力作用下黏度迅速下降趋势.胞外多糖加入脱脂乳溶液中能够明显的增加脱脂乳的黏度,且溶液的黏度下降变慢.在试验的频率范围内,随着胞外多糖溶液质量浓度的增加,对应的交叉频率的值相应变大,胶体特征越明显.     

酪蛋白糖巨肽通过树突细胞发挥免疫调节作用的初步研究

研究用酪蛋白糖巨肽(CGMP)刺激体外培养的小鼠骨髓源树突细胞,观察CGMP对树突细胞成熟的影响,初步探讨CGMP作为功能性食品对免疫的调节作用。实验选用6～8周雄性C57BL/6小鼠,分离培养小鼠骨髓细胞,用重组小鼠白细胞介素-4 (rmIL-4)、重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)诱导其分化,在培养的第6天,分别加入RPMI1640完全培养基作为空白对照, 脂多糖(LPS)为阳性对照和0.1、1、10μg/mL的CGMP 3个实验剂量。培养至第8天收集细胞,进行三色荧光标记,用流式细胞仪检测细胞表面标志：CD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ。另一方面将第8天的树突状细胞(DCs)和T淋巴细胞共孵育进行混合淋巴细胞反应,96h后用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)检测T淋巴细胞的增殖。结果表明：3个剂量的CGMP均具有刺激DCs成熟的作用,其中CGMP为1μg/mL时,DCs的各种成熟标志均达到最高水平,其中,CGMP对MHC-Ⅱ的刺激作用最为强烈,而MHC-Ⅱ在DCs对外源抗原的提呈中发挥重要作用;混合淋巴细胞反应结果显示各个不同浓度CGMP作用的DCs均具有不同程度的刺激T淋巴细胞增殖的能力,并且DCs:T为1:10时T淋巴细胞的增殖作用最明显。     

植物乳杆菌胞外多糖的脱色及其体外抑瘤效应

研究大孔吸附树脂对植物乳杆菌胞外多糖的脱色工艺,并采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测植物乳杆菌胞外多糖EPS及单一组分EPS-1、EPS-2对大肠癌细胞株HT-29的体外抑瘤效应。结果表明,选择S-8树脂,树脂用量为4g/100mL,调节胞外多糖溶液的pH值为6,在25℃条件下,糖液质量浓度为2mg/mL,静态吸附4h后脱色率为72.58%,糖保留率为69.15%。植物乳杆菌胞外多糖EPS、EPS-1和EPS-2对大肠癌细胞HT-29的体外增殖均具有显著的抑制作用(P＜0.01),且呈现出良好的量效关系。     

植物乳杆菌C88联合人参多糖的免疫调节作用

以环磷酰胺诱导昆明小鼠建立免疫抑制模型后,分别给其灌胃人参多糖、人参多糖联合植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）C88。实验结束后,采用酶联免疫吸附实验检测了小鼠血清中的白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）、白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）、白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）、干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）,并利用碳廓清法检测了小鼠吞噬细胞吞噬能力,评价了人参多糖（water-soluble ginseng polysaccharides,WGPA）联合植物乳杆菌C88的体内免疫调节作用。结果表明WGPA联合益生菌C88可明显增强免疫抑制小鼠吞噬细胞的吞噬能力和迟发型超敏反应,显著上调血清中IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α、IgG水平,下调IL-10水平,并呈现剂量依赖性,且联合用药组的作用明显强于人参多糖WGPA单独用药组。综上所述,植物乳杆菌C88联合人参多糖可以发挥一定的免疫调节作用。     

白藜芦醇对小鼠脾淋巴细胞免疫调节活性的影响

研究了白藜芦醇（Res）对小鼠脾淋巴细胞免疫调节活性的影响。无菌分离小鼠脾,制备淋巴细胞,并用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养,在培养液中分别加入刀豆蛋白A（Con A）、脂多糖（LPS）以及5、10、20、40μg/m L不同浓度的Res,经过不同时间培养后,采用MTT法检测淋巴细胞的增殖,ELISA法检测淋巴细胞分泌IL-4和IL-12的水平,流式细胞仪检测淋巴细胞的细胞周期和细胞膜表面标志。结果表明:Res能够促进小鼠脾淋巴细胞增殖,能与Con A协同促进小鼠脾淋巴细胞增殖,不能与LPS协同促进小鼠脾淋巴细胞增殖;能增强IL-4和IL-12的分泌;能提高小鼠脾淋巴细胞CD4+/CD8+的比值;能提高脾淋巴细胞周期中细胞进入S期细胞的百分率。综上,Res能增强小鼠脾淋巴细胞的免疫调节活性。      

体外评估乳杆菌对巨噬细胞RAW264.7免疫调节作用的影响

该研究以商业菌株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG为阳性对照菌,体外评估实验室保藏的5株乳杆菌对巨噬细胞RAW264.7细胞活性、吞噬活性及免疫活性分子NO、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与白细胞介素-10（IL-10）分泌水平的影响,以期从中筛选出具良好免疫调节作用的菌株。结果表明,鼠李糖乳杆菌260具有更优的免疫调节作用,在特定乳杆菌活菌浓度时,能显著提高巨噬细胞RAW264.7的细胞活性、吞噬活性及NO、TNF-α和IL-10的分泌水平（P＜0.05）。最高细胞增殖率为196.62%;最低乳酸脱氢酶（LDH）释放量为554.36 U/100 mL;最高吞噬活性为136.86%;最高NO分泌量为5.70 μmol/L;最高IL-10分泌量为15.56 pg/mL,最高TNF-α分泌量为50.98 pg/mL。     

Immune enhancing effects of Lactobacillus acidophilus LAFTI L10 and Lactobacillus paracasei LAFTI L26 in mice

The immune enhancing properties of Lactobacillus acidophilus LAFTI L10 and Lactobacillus paracasei LAFTI L26 in mice were investigated. Each mouse (BALB/c) was orally fed with cultures of either L. acidophilus or L. paracasei at 10(8) CFU/50 mul per day for 14 days. The effect of these strains on immunoglobulin A, interleukin-10 and interferon gamma producing cells in the gut immune system was determined by immunofluorescence assays. Systemic immune responses were analysed in mice serum upon euthanising after a 14-day feeding trial to estimate cytokines such as IL-10 and IFN-gamma by enzyme-linked immunosorbent assays. L. acidophilus and L. paracasei strains demonstrated an increase in the number of IgA producing cells, IL-10 and IFN-gamma cytokine producing cells in the small intestine. In the systemic immune response, mice fed with L. acidophilus or L. paracasei also enhanced the secretion of anti-inflammatory cytokine (IL-10) and pro-inflammatory cytokine (IFN-gamma). The results of this study suggest that L. acidophilus and L. paracasei were able to enhance specific gut and systemic immune responses in mice.     

干酪乳杆菌胞外多糖诱导小鼠骨髓来源树突细胞成熟以及分泌IL-6、TGF-β和IL-23

为研究干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）促进体外培养的小鼠未成熟骨髓来源树突细胞（bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs）成熟的作用,分析不同剂量的EPS对BMDCs分泌细胞因子白细胞介素（interleukin,IL）-6、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）和IL-23的影响,并检测EPS对BMDCs抗原提呈能力的影响。首先从干酪乳杆菌中分离纯化出EPS,并检测EPS的纯度;把从BALB/c小鼠体内分离出的骨髓细胞分化为BMDCs,未成熟BMDCs分别与磷酸盐缓冲液、不同剂量EPS和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）体外培养,采用流式细胞法检测了BMDCs成熟表面标记物MHC II和CD86的表达,酶联免疫吸附检测（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法分析了IL-6、TGF-β和IL-23的表达量,CCK-8法检测了BMDCs与小鼠脾淋巴细胞的混合培养体系中淋巴细胞的增殖率。结果表明：分离出EPS的纯度约为95%;EPS能够上调BMDCs表面MHC II和CD86的表达量;EPS可以显著促进BMDCs分泌IL-6、TGF-β和IL-23（P＜0.05）,但促进水平低于LPS;EPS可以明显促进BMDCs刺激异基因淋巴细胞的增殖。综上所述,在体外实验中,干酪乳杆菌EPS能够促进BALB/c小鼠BMDCs的成熟,诱导BMDCs分泌与辅助性T17细胞分化和增殖相关的细胞因子IL-6、TGF-β和IL-23,并且可以增强BMDCs的抗原提呈能力。     

植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对免疫抑制小鼠肠道黏膜免疫的影响

目的：探讨植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆对免疫抑制小鼠肠道黏膜免疫的影响。方法：利用环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型,将小鼠随机分为5 组,即正常对照组、模型组、胡萝卜原浆组、发酵胡萝卜浆组、灭活发酵胡萝卜浆组。小鼠以灌胃的方式给予胡萝卜原浆、发酵胡萝卜浆和灭活发酵胡萝卜浆后,分别测定各组小鼠胸腺指数和脾脏指数,酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）方法测定小肠组织白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-10和分泌型免疫球蛋白A（secretory immunglobulin A,sIgA）含量,小肠组织病理学观察及直接免疫荧光检测IgA分泌B细胞数。结果：实验组与模型组相比,植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆能显著提高小鼠胸腺和脾脏指数,增加IgA分泌B细胞数量,提高细胞因子IL-2和sIgA的水平,改善肠道形态结构,但TNF-α和IL-10含量没有显著增加。结论：植物乳杆菌NCU116发酵胡萝卜浆能有效拮抗环磷酰胺对小鼠免疫功能的抑制作用和肠道结构损伤作用,提高免疫抑制小鼠的免疫功能和改善肠道形态结构。     

酸笋中具有抗炎活性乳酸菌的筛选及鉴定

从柳州采集的3 份酸笋发酵液样品中分离筛选得到46 株疑似乳酸菌菌株,通过耐酸、耐胆盐、模拟胃肠道实验以及体外黏附HT-29细胞和NO实验进行益生特性和抗炎活性研究,筛选得到1 株具有优良抗炎活性菌株SS-31,经16S rRNA基因序列测序鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）。结果表明：菌株SS-31具有较强耐酸能力,0.1%牛胆盐处理3 h后活菌数为107 CFU/mL,存活率高达90.02%;模拟人工胃液消化2 h后存活率为80.28%,模拟人工肠液处理2 h后存活率为3.63%;SS-31在体外对HT-29细胞有较高黏附性,黏附率为4.47%,略低于对照菌鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LGG（4.95%）;在体外脂多糖刺激RAW264.7细胞炎症中,与模型组相比,SS-31组显著下调炎性物质NO分泌量（P＜0.05）;此外,SS-31能显著下调炎症因子白细胞介素（interleukin,IL）1β、IL-6的含量（P＜0.05）。从酸笋发酵液中筛选得到1 株具有优良益生特性的发酵乳杆菌SS-31,初步证明了乳酸菌SS-31在治疗炎症中具有潜在应用和开发价值。     

免疫低下和食物过敏小鼠外周血中细胞因子的变化

建立小鼠免疫低下模型和食物过敏模型,采用ELISA法检测外周血中细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、TGF-β)的变化。结果表明：与空白对照组比较,腹腔注射环磷酰胺所建立免疫低下小鼠胸腺指数和脾脏指数均有显著降低(P≤0.05),且在第3天达到最低;经卵清蛋白致敏小鼠外周血IgE水平极显著升高(P≤0.01)。免疫低下小鼠外周血中IFN-γ(除第3天外)、TGF-β含量(除第3天外)和IFN-γ/IL-4比值均显著降低,而IL-10水平也有下降趋势;除第2天外IL-6水平显著升高,但IL-4水平只在第3天显著性增高,IL-12先是下降随后呈现增多的趋势;食物过敏小鼠的IL-4、IL-6、IL-10和TGF-β水平均有显著性增高,IFN-γ/IL-4比值有显著性下降,而IFN-γ和IL-12没有明显的变化。因此,免疫低下和食物过敏小鼠的Th1/Th2细胞平衡均向Th2细胞偏移,免疫低下对Th1细胞的影响大,食物过敏对Th2细胞的影响更明显。     

Induction of interleukin-12 by Lactobacillus strains having a rigid cell wall resistant to intracellular digestion

Some strains of lactobacilli can stimulate macrophages and dendritic cells to secrete IL-12, which plays a key role in activating innate immunity. We examined the IL-12-inducing ability of 47 Lactobacillus strains belonging to 10 species in mouse peritoneal macrophages, and characterized the properties important for the induction of IL-12. Although considerable differences in IL-12-inducing ability were observed among the strains tested, almost all strains belonging to the Lactobacillus casei group (L. casei, Lactobacillus rhamnosus, and Lactobacillus zeae) or to Lactobacillus fermentum induced high levels of IL-12. Phagocytosis of lactobacilli was necessary for IL-12 induction, and the strains with strong IL-12 induction were relatively resistant to lysis in the macrophages. The sensitivity of Lactobacillus strains to in vitro treatment with M-1 enzyme, a member of the N-acetylmuramidases, was negatively correlated with IL-12-inducing ability. Using a probiotic strain, L. casei strain Shirota (LcS), we showed that the cell wall of LcS could be digested by long-term treatment with a high dose of M-1 enzyme and that the IL-12-inducing ability was diminished according to the duration of the enzyme treatment. The soluble polysaccharide-peptidoglycan complex released from the cell wall of LcS did not induce IL-12, whereas the insoluble intact cell wall of LcS induced IL-12. These results suggest that the intact cell wall structure of lactobacilli is an important element in the ability to induce IL-12 and that Lactobacillus strains having a rigid cell wall resistant to intracellular digestion effectively stimulate macrophages to induce IL-12.     

植物乳杆菌C21胞外多糖的分离纯化及其结构修饰

为研究乳酸菌胞外多糖的结构和性质,采用乙醇沉淀、DEAE- 纤维素离子交换柱层析和 Sepharose CL-6B凝胶过滤层析方法从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) C21 SDM 液体培养基中分离纯化得到一种均一组分的胞外多糖,命名为PCPc。采用离子色谱和红外光谱法对其单糖组成和结构进行初步分析,结果表明,PCPc 主要由半乳糖和葡萄糖两种单糖组成,其物质的量比为1:2。并对PCPc 多糖进行化学修饰,获得了其硫酸化和磷酸化衍生物。