毕赤酵母产重组木聚糖酶发酵条件的优化及其酶学性质

目的优化毕赤酵母工程菌GS115/xyn11A产重组木聚糖酶的发酵条件,并检测其酶学性质。方法采用单因素试验和L(934)正交试验考察摇瓶发酵条件下培养基起始pH值、诱导剂甲醇添加量、诱导温度及诱导时间对产酶活性的影响;并分析重组木聚糖酶的酶学性质。结果影响重组毕赤酵母产酶的因素重要性依次为:培养基起始pH值>诱导时间>诱导温度>甲醇添加量,重组酵母产酶最佳条件为:起始pH值7.5,甲醇添加量1.5%,32℃诱导96 h,在此条件下进行诱导表达重组木聚糖酶的酶活性可达228.35 IU/ml;酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH值为5.5,在低于40℃和pH 4.5～7.5的范围内较稳定。结论优化了毕赤酵母产重组木聚糖酶的发酵条件,为木聚糖酶的工业化生产及应用提供了依据。     

废弃毕赤酵母核糖核酸提取条件的优化

为了确定废弃毕赤酵母提取核糖核酸的提取工艺条件,首先通过单因素试验研究了溶液pH、酵母浓度、抽提温度和抽提时间对毕赤酵母核糖核酸提取的影响,然后采用正交试验分析法对提取核糖核酸的影响因素进行了优化。优化结果表明,毕赤酵母核糖核酸提取的最佳工艺条件为:酵母浓度为3%,pH=10,抽提温度为100℃,抽提时间为2.5 h,在此条件下,核糖核酸的提取率可达3.11%。     

驯化树干毕赤酵母发酵产乙醇的研究

以玉米秸秆蒸汽爆破液为底物培养基,通过逐步提浓的方式对树干毕赤酵母菌株（Pichiastipitis）NLP23进行耐抑制物驯化,驯化后的菌株对汽爆液中甲酸和乙酸等抑制物的耐受能力可分别达到2．70g／L和3．54g／L,较出发菌株分别提高253．40％和277．80％。在含有57．34g/L木糖和13．84g／L葡萄糖的汽爆液中发酵42h,糖利用率和乙醇得率可达到97．89％和65．83％,乙醇质量浓度为21．56g/L,同时生成4．16g/l木糖醇。玉米秸秆蒸汽爆破液中含有多种抑制酵母生长和发酵的有毒物质,主要是甲酸、乙酸、乙酰丙酸、糠醛和羟甲基糠醛,其中甲酸和乙酸含量较高,是影响树干毕赤酵母NLP23发酵汽爆液的主要抑制物。     

人溶菌酶基因在毕赤酵母中的表达及发酵条件的优化

目的在毕赤酵母中表达人溶菌酶(Human lysozyme,hLY)基因,并对发酵条件进行优化。方法将人工合成的hLY成熟肽基因克隆至表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115,通过抗G418筛选获得高拷贝重组子GS115/hly,经甲醇低温诱导表达后,取发酵液上清进行SDS-PAGE分析及酶活性检测,并对培养基初始pH值、甲醇添加量、诱导温度和时间进行优化。结果人工合成的hly测序结果与GenBank中报道的核酸序列完全一致;GS115/hly经PCR鉴定,hly基因已整合入GS115基因组内;经甲醇诱导表达的GS115/hly发酵液上清具有溶菌活性,活性达30U/ml;经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约15200处可见目的蛋白条带;GS115/hly的最佳诱导条件为:培养基初始pH5.0,甲醇添加量2.0%,26℃诱导108h。结论在毕赤酵母GS115中表达了具有较高酶活性的hLY,并对发酵条件进行了初步优化。     

季也蒙毕赤酵母DQ11发酵酒糟水解液生产木糖醇条件的优化

目的优化季也蒙毕赤酵母DQ11发酵酒糟水解液生产木糖醇的条件。方法通过单因素试验和正交试验,优化季也蒙毕赤酵母DQ11发酵酒糟水解液生产木糖醇的发酵温度、初始pH值、转速和接种量,通过高效液相色谱法测定发酵液中木糖醇的含量;采用最佳发酵条件发酵生产木糖醇,检测木糖醇含量。结果摇瓶发酵酒糟水解液生产木糖醇的最佳条件为:发酵温度28℃,起始pH值5.0,接种量5%(v/v),摇床转速180 r/min;以最佳条件发酵酒糟水解液生产木糖醇的含量为9.016 g/L。结论优化了季也蒙毕赤酵母DQ11发酵酒糟水解液生产木糖醇的条件,为以酒糟生产木糖醇的可能性提供了实验依据。     

红发夫酵母摇瓶培养条件的优化

虾青素是一种极具潜力的色素和抗氧化剂,在水产养殖、饲料、食品和医药工业具有广阔的应用前景。本文对产虾青素的红发夫酵母的培养基优化进行了研究。摇瓶培养正交实验优化条件下,红发肤酵母的生物量为11．16g／L,比初始条件下的酵母生物量提高了57％;虾青素含量为0．70mg／kg,提高了66％;虾青素产量为7．83mg／L,提高了1．6倍。     

碱性纤维素酶基因在巴氏毕赤酵母中的表达及重组酵母菌发酵工艺的优化

目的克隆碱性纤维素酶基因,构建酵母整合型表达质粒,在巴氏毕赤酵母中表达,并对重组菌的发酵工艺进行优化。方法应用PCR技术从嗜碱性芽孢杆菌ATCC21833中扩增碱性纤维素酶基因,克隆至酵母整合型表达载体pGAPZαA中,构建重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833,并转化至巴氏毕赤酵母GS115。通过单因素实验及正交实验,确定重组酵母的最佳发酵培养基。在20L发酵罐中进行高密度发酵,观察碳源对批式发酵的影响,并检测在4种流加方式(连续恒速流加、间歇匀速流加、间歇递减流加、维持底物浓度流加)下的菌体干重及发酵液中的酶活性。结果重组表达质粒pGAPZαA-ATCC21833经酶切及DNA测序证明构建正确,其基因序列与嗜碱性芽孢杆菌KSM-635的碱性纤维素酶基因序列一致。最佳发酵培养基组成为6%葡萄糖、2%硫酸铵、12g/L磷酸二氢钾。碳源浓度对于重组酵母菌体生长及产酶至关重要。SDS-PAGE表明表达产物的相对分子质量约为103000。维持底物浓度的流加方式可获得最高的菌体干重(29.8g/L)及酶活力(24U/ml)。结论已成功构建了表达碱性纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌,并确定了维持底物浓度的流加方式为最佳发酵方式。     

深红酵母摇瓶发酵生产β-胡萝卜素工艺条件的研究

探讨了利用深红酵母摇瓶发酵生产β-胡萝卜素的工艺条件,主要从培养基配方、培养条件以及破壁方法等三个方面进行了优化研究。通过多因素实验确定了深红酵母的最佳培养基配方为:葡萄糖4%,蛋白胨0.7%,酵母膏0.3%,Ca2+0.02%,维生素B23.5 mg/L,优化后β-胡萝卜素产量提高了12.24%;最佳培养条件为:温度28℃,pH 6.0,接种量6%,装液量80 mL/250 mL,优化后β-胡萝卜素产量提高了20.11%;最佳的破壁方法是酸热法。     

含抗菌肽CC31毕赤酵母工程菌培养基及其培养条件的优化

目的筛选毕赤酵母工程菌培养基的主要组分,优化工程菌培养条件。方法采用毕赤酵母工程菌CC31发酵培养抗菌肽CC31,选取基础盐培养基(basic salt medium,BSM)为初始培养基,利用单因素试验、正交试验设计对培养基的碳源、氮源、酵母营养物进行筛选;选取最适培养基对菌种接种量、培养基初始pH值、培养温度进行培养条件优化。结果经鉴定,抗菌肽CC31相对分子质量为13 620;初始BSM培养基添加组分中碳源为3%甘油和3%葡萄糖,酵母营养物为1%酵母浸出物,氮源为1. 5%硫酸铵;在10%接种量、培养基初始pH值为6,培养温度为30℃的培养条件下,获得的抗菌肽CC31蛋白浓度可达82 mg/L。结论优化了毕赤酵母工程菌培养基组分及培养条件,获得高表达量的重组蛋白,为工业化高密度发酵提供了实验依据。     

重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产物的生成和降解

目的　研究重组毕赤酵母高密度发酵表达水蛭素过程中产物的生成和降解。方法　通过质谱和氨基酸序列分析确定水蛭素的 4种活性异构体 ,再用HPLC监测发酵过程中水蛭素的降解情况。结果　发酵过程中产生了 4种具有较高比活的水蛭素异构体 ,它们分别是目的产物水蛭素Hir6 5及Hir6 5的C 末端降解 1～ 3个氨基酸的产物。发酵时细胞干重达到 16 2g/L ,水蛭素的总活性一直在增加 ,最高为 2 .4 5× 10 4ATU/ml,相当于总产量1.8g/L。但Hir6 5在 4种水蛭素异构体总量中的比例一直在下降。Hir6 5的产量先升高再降低 ,最高为 2 80mg/L。结论　毕赤酵母发酵过程中水蛭素存在降解 ,Hir6 5降解产生了Hir6 2和Hir6 3。     

Continuous production of thrombomodulin from a Pichia pastoris fermentation

A rotary membrane separation system was used in a continuous fermentation of Pichia pastoris with cell recycling to obtain high cell concentration and high thrombomodulin production. The dilution rates of this continuous fermentation were between 0·25 and 0·35 dm³ day⁻¹, and the production process was maintained for 10 days. Since cells were recycled and only part of liquid broth was taken from the system, a very high cell concentration level (248 g dm⁻³) was obtained. The peak protein expression level was at 72 h after methanol induction, was 300 mg dm⁻³ (3·6 × 10⁵ activity unit cm⁻³) and the total harvested supernatant was three times the working volume.     

甲醇营养型重组毕赤酵母高效表达外源蛋白过程的控制与优化(英文)

The methylotrophic yeast Pichia pastoris is a highly successful system for production of a variety of heterologous proteins due to its unique features/abilities for effective protein expression, and tremendous efforts have been made to increase heterologous protein productivity by P. pastoris in recent years. When new engineered yeast strains are constructed and are ready to use for industrial protein production, process control and optimization techniques should be applied to improve the fermentation performance in the following aspects: (1) increase recombinant cell concentrations in fermentor to high density during growth phase; (2) effectively induce heterologous proteins by enhancing/stabilizing titers or concentrations of the proteins during induction phase; (3) decrease operation costs by relieving the working loads of heat-exchange and oxygen supply. This article reviews and discusses the key and commonly used techniques in heterologous protein production by P. pastoris, with the focus on optimizations of fermentation media and basic operation conditions, development of optimal glycerol feeding strategies for achieving high density cultivation of P. pastoris and effective heterologous protein induction methods by regulating specific growth rate, methanol concentration, temperatures, mixture ratio of multi-carbon substrates, etc. Metabolic analysis for recombinant protein production by P. pastoris is also introduced to interpret the mechanism of sub-optimal heterologous protein production and to explore further optimal expression methods.     

乙酰肝素酶大亚基在毕赤酵母中的表达

目的构建乙酰肝素酶(HPA)大亚基片段真核表达质粒,并在毕赤酵母中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的HPA大亚基基因序列设计引物,PCR方法扩增肝素酶基因,构建毕赤酵母真核表达质粒pPICZαA-HPA。电击穿孔法转化感受态毕赤酵母SDM1168,斑点免疫印迹法筛选重组菌株,PCR法鉴定阳性克隆。甲醇诱导表达重组蛋白,Western blot鉴定表达产物。结果构建的重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;斑点免疫印迹法筛选出的9个单菌落经PCR扩增,均可见1161bp的目的基因条带;表达产物经Western blot分析,具有良好的反应原性,表达量约为5μg/L。结论已成功构建了HPA大亚基片段真核表达质粒pPICZαA-HPA,并在毕赤酵母SDM1168中分泌表达了HPA大亚基。     

多拷贝重组HBsAg质粒的构建及在毕赤酵母中的高效表达

目的通过构建多拷贝数表达质粒,获得高表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。方法通过对单拷贝表达质粒进行改造,将表达盒(5′AOX-HBsAg-TT)重复导入载体,构建多拷贝数表达质粒。通过电转化、15L规模发酵和纯化,获得纯化HBsAg颗粒,并对表达产物的特异性、免疫原性及表达量与拷贝数间的关系进行分析。结果多拷贝数重组毕赤酵母的表达产物经ELISA、SDS-PAGE、Western blot检测,显示出良好的特异性,电镜观察证明表达产物能够自发装配成22nm类病毒颗粒(VLP),其表达量与拷贝数呈正相关,拷贝数提高未对菌体正常生长带来影响,HBsAg制备的免疫原能有效刺激小鼠产生保护性抗体。结论含多拷贝数表达质粒的工程菌可显著提高毕赤酵母HBsAg表达量。