快速选育抗黄瓜花叶病毒的转基因烟草纯合品系

以来源于烟草推广品种ＮＣ８９花药的单倍体苗为转化受体，同时导入了黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和卫星ＲＮＡ（Ｓａｔ—ＲＮＡ）基因，在获得的共１１２株转化植株中，有３株在人工接种浓度高达２００μｇ／ｍｌ的ＣＭＶ时仍不发病。通过０．４％秋水仙素处理使之加倍并收获种子，而后连续两代在大田条件下鉴定其ＣＭＶ抗性及综合农艺性状，并与单独导入了ＣＭＶＣＰ基因或ＣＭＶＳａｔ—ＲＮＡ基因的转基因ＮＣ８９品系及未转化的对照ＮＣ８９进行了比较。结果表明，同时表达ＣＭＶ外壳蛋白和卫星ＲＮＡ的双单倍体转基因植株，在Ｒ—１代即表现出一致的可稳定遗传的ＣＭＶ抗性，抗性水平较单独表达ＣＰ或Ｓａｔ—ＲＮＡ的转基因ＮＣ８９提高１倍左右。     

抗赤星病烟草的防卫基因的表达与基因组DNA结构的变化

用赤星病菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｍａｔａ）毒性菌株产生的ＡＴ毒素诱导烟草,可使寄主获得对赤星病８０．４％的系统抗性,比病菌弱毒株ＴＢＡ１６孢子诱导的效果高约２０％。烟草品种ＮＣ８９心叶叶碟在含ＡＴ毒素６０％和７０％的ＭＳ培养基上经２轮胁迫筛选和植株再生,得到抗病品系ＮＣ８９－ＴＴ。用５种防卫基因的ｃＤＮＡ探针检测了不诱导、受ＡＴ毒素诱导、受病菌弱毒株激发子诱导的ＮＣ８９和诱导与不诱导的ＮＣ８９－ＴＴ第４代植株５种基因的转录活性,结果表明,苯丙氨酸氨裂解酶（ＰＡＬ）基因在ＮＣ８９中不能组成型表达,可被ＡＴ毒素诱导激活,但不受激发子诱导;病程相关蛋白（ＰＲ蛋白）ＰＲ－ｌａ、查尔酮合成酶（ＣＨＳ）、脂氧合酶（ＬＯＸ）基因在ＮＣ８９中表现为诱导转录或诱导后转录活性增强;这４种基因都在ＮＣ８９－ＴＴ中组成型表达     

转抗虫基因烟草NC89纯合品系的获得及大田抗虫试验

经过连续三代抗虫性鉴定，选育出了表达直豆胰蛋白酶抑制剂（ＣＰＴＩ）的广谱抗虫转基因烟草ＮＣ８９纯合品系ＮＣ８９Ｌ２７－１９和ＮＣ９８Ｌ２７－２１。在大田对两个纯合系的抗虫性状进行了研究。①人工接种烟青虫；②害虫自然发生，不施杀虫剂；③在同一虫害防治阈值时施用杀虫剂。结果表明：转基因品系可稳定表达抗虫性状。在不施用杀虫剂时，田间相对抗虫效果在６４．７％～７０．５％之间；在施用杀剂时，可减少用药量４０％左右。转基因品系仍维持原ＮＣ８９主要植物学特性及农艺性状，为ＮＣ８９品种的抗虫改良品系。     

快速选育抗黄瓜花叶病毒的转基因烟草纯合品系

以来源于烟草推广品种ＮＣ８９花药的单倍体苗为转化受体，同时导入了黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因和卫星ＲＮＡ（Ｓａｔ－ＲＮＡ）基因，在获得的共１１２株转化植株中，有３株在人工接种浓度高达２００μｇ／ｍｌ的ＣＭＶ时仍不发病。通过０．４％秋水仙素处理使之加倍并收获种子，而后连续两代在大田条件下鉴定其ＣＭＶ抗性及综合农艺性状，并与单独导入了ＣＭＶＣＰ基因或ＣＭＶＳａｔ－ＲＮＡ基因的转基因ＮＣ     

烟草抗病新品系“转基因NC89”的大田试验

对转“黄瓜花叶病毒外壳蛋白（ＣＭＶＣＰ）＋卫星ＲＮＡ”嵌合基因的工程ＮＣ８９的Ａ、Ｂ、Ｃ三个纯系以及转“ＣＭＶＣＰ＋烟草花叶病毒外壳蛋白（ＴＭＶＣＰ）”嵌合基因的工程ＮＣ８９Ｔ纯系进行了田间抗病性鉴定及农艺性状测试，结果表明：不论在人工接毒或自然发病条件下，转基因ＮＣ８９的花叶病病情指数都明显低于未转基因ＮＣ８９对照，其中Ｂ纯系的抗病性最高，在上述条件下，相对防效分别达到８０．２％、９２．９５％。在农艺性状方面，转基因ＮＣ８９较对照有所改善，但种性未变。     

烤烟高抗赤星病气候斑点病普通花叶病新种质CV87选育利用研究

ＣＶ８７新种质资源是中国农业科学院烟草研究所用抗花叶病、赤星病、气候斑点病主抗源ＣＶ５８作母本与美国引进抗根茎病害优质品种主亲源（Ｇ２８×ＮＣ８２）Ｆ１组合做父本多亲本复交系统育成。主要农艺性状遗传稳定。综合经济性状良好。具兼高抗赤星病（病指５．８８～６．１９）、气候斑点病（发病率０．５６％～６．３３％）、普通花叶病（发病率和病指０）突出特点,均属高抗型。但感染野火病。对赤星病其抗性略优于抗病对照品种（系）ＣＶ５８。而感病对照品种ＮＣ８９,赤星病病指达４２．３０～４８．９３,气候斑点病发病率达３０．３３％～５８．６０％,均属感病型。ＣＶ８７是目前烟草抗赤星病、气候斑点病、普通花叶病育种最优良多抗源的新种质资源,在病区应用ＣＶ８７进行大面积生产试验示范,防病效果和效益均十分显著。     

烟草抗花叶病新品系“转墓因NC89”选育技术的研究

本文报导了国内首例抗烟草花叶病毒（ＴＭＶ）和黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）的转基因双抗烟草新品系的选育方法，获得了具有抗ＴＭＶ和ＣＭＶ的双抗优质新品系。在新品系第４—６代的田间试验中，验证了其抗病毒特性的遗传稳定性；与对照品种ＮＣ８９在农艺性状、品质和烘烤特性等方面进行比较，证明转基因抗病新品系除抗病性显著增强外，其它特性均略优于原ＮＣ８９良种。１９９２年在河南省示范推广６６６７ｈｍ~２，转基因抗病新品系对烟草花叶病的相对控制效果为５０％－７０％，防病增产的经济效益显著。     

烟草赤星病抗性鉴定方法的研究

建立了一种在温室内通过人工接种离体叶片快速鉴定烟草赤星病抗性的技术。在２５℃～２８℃，湿度８０％～９０％条件下，将烟草赤星病菌直接接种于离体叶片上，培养６～９天后，离体叶片的发病率及病级与其植株水平上对赤星病菌的抗性表现极显著相关。该技术能反应烟草在田间病圃内的抗病或感病程度，从而可以做为鉴定指标。     

烟草赤星病的生物防治研究进展

综述了植物诱导抗性、微生物拮抗作用、转基因技术在烟草赤星病的生物防治上研究现状,并对植物诱导抗性、植物源杀菌剂的研究与应用和筛选烟草赤星病菌拮抗菌等方面进行了展望。     

利用双层培养基筛选烟草抗赤星病突变体

在接种有赤星病菌(Alternaria alternata)的双层培养基上,成功地从高感赤星病烟草品种 NC89的花药中诱导出突变体苗,对这些突变体苗进行了离体抗病性鉴定,结果表明:其中70％的植株不同程度地表现赤星病抗性,部分表现高度抗性。     

烟草对赤星病菌的抗性与其防御酶系活性的关系

室内对抗病性不同的烟草品种CV 87和NC 89接种赤星病菌 ,分析测定接种后不同时间、不同叶位过氧化物酶 (POD)、过氧化氢酶 (CAT)以及苯丙氨酸解氨酶 (PAL)等同工酶酶活性变化情况。结果表明 ,抗病品种CV 87随接种叶位升高POD与CAT活性增加 ,感病品种NC 89表现先升高后降低的趋势。无论接种与否NC 89的POD活性都高于CV 87;抗病品种CV 87的CAT活性高于感病品种 ;接种赤星病菌后,抗病品种CV 87的PAL活性升高 ,感病品种NC 89的PAL活性降低 ,PAL活性与品种抗病性呈正相关     

利用母本来源的单倍体技术获得双抗TMV和PVY烟草株系

利用双单倍体技术可加快杂交后代目标性状的纯合。为了选育双抗烟草花叶病毒（TMV）和马铃薯Y病毒（PVY）的烟草材料,本文采用Coker176与NC55的F1与非洲烟杂交获得单倍体苗,经过苗期抗性鉴定、分子标记辅助选择和叶脉培养加倍,获得母本来源的双抗TMV和PVY的双单倍体。通过人工接种抗性鉴定、标记检测和田间株系比较,获得抗性、植物学性状稳定的双单倍体第三代种子。与常规杂交系统选育相比较,双单倍体方法的获得后代变异更大、性状更容易稳定。      

沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草

  目的  本研究利用dsRNA技术沉默2b基因,获得烟草品种云烟85的T₁代转基因抗CMV株系。  方法  构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b（r）-In-2b（i）,以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草（Nicotiana tabacum）品种云烟85。  结果  抗性筛选获得112株T₀代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T₀代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病。Tas-ELISA检测表明,T₀代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株。选取10个T₀代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T₁代抗病性,发现部分T₁代烟株发生一定比例的抗感分离,T₁代抗性株率为46.7%~100%。Real-time PCR检测T₁代烟株,发现T₁代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株。  结论  基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系。      

山西葡萄中链格孢菌分离鉴定与污染水平分析

本研究对山西葡萄主产区的巨峰葡萄（Kyoho grapes）和红提葡萄（Redglobe table grapes）上的主要病原真菌（链格孢菌）进行纯化分离、真菌形态学鉴定、分子生物学鉴定,并对链格孢菌产毒能力进行检测分析。研究表明,链格孢菌（Alternaria alternata）侵染山西葡萄具有一定的品种选择性。链格孢菌菌株产生的毒素主要以细交链孢菌酮酸（TEA）为主。本研究初步明确了山西葡萄（巨峰葡萄和红提葡萄）中链格孢菌的污染水平。     

转几丁质酶基因烟草遗传稳定性研究

从转几丁质酶基因烟草株系(NPTII基因是选择标记基因)对卡那霉素的抗性,及外源几丁质酶基因表达蛋白的活性(Western Blot检测)两个方面对转基因株系的遗传稳定性进行了分析研究。在卡那霉素抗性检测试验中,检测了13个T₂转基因株系,其中9个株系被检测种子100%对卡那霉素(100 mg/L)具有抗性;T₃和T₄转基因株系各检测了10个,100%被检测种子在含卡那霉素100 mg/L的MS培养基上长成了烟苗。Western Blot检测了11个T₂株系,检测结果表明,6个株系被检测植株100%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株80%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株50%含有外源几丁质酶蛋白,1个株系被检测植株19.05%含有外源几丁质酶蛋白。在温室内将转基因烟草与未转基因烟草密植在一起,种植2代,烟株开花期模仿自然风力对烟株吹风,进行了转基因烟草是否可以通过花粉进行基因漂移的研究。研究结果表明,在自然风媒条件下未发现转基因烟草可进行基因漂移。      

烟草病原真菌拮抗性内生细菌的筛选

为利用有益微生物防治烟草某些病害,从7个烤烟品种(云烟85、红大、K326、K346、RG11、G28和NC89)不同生育期的根、茎、叶中分离获得内生细菌1729株,并通过平板对峙培养法筛选出对烟草灰霉病菌、黑胫病菌、赤星病菌和炭疽病菌有较好拮抗活性的菌株61、38、52和55株。结果显示,在各个品种、各个时期及根、茎、叶中均有不同数量拮抗这4种病原菌菌株存在。     

烤烟新品种龙烟101的选育及特征特性

龙烟101是以优质、抗烟草普通花叶病毒病（tobaccomosaicvirus,TMV）、适应性强为育种目标,采用烤烟品种龙江925为母本,抗TMV品种CV91为父本,杂交后经系谱法选育而成的免疫TMV烤烟新品种。多年试验结果表明,龙烟101遗传性状稳定,植株结构及田间群体结构合理,田间生长势强、耐连作;免疫TMV,中抗黑胫病,靶斑病较轻,感青枯病、CMV和PVY,综合抗性与对照NC89相当;主要经济性状和原烟外观质量优于对照NC89,化学成分较适宜,感官质量与对照NC89相当。综合评价,龙烟101在品质、产量和抗病、抗逆性等方面均较好,适宜东北烟区和黄淮部分烟区种植。     

烤烟新品种豫烟10号的选育及特征特性

豫烟10 号是以自选烤烟品系农大201 为母本,云烟87 为父本杂交,经系谱法定向选择培育而成。全国及河南省区域试验结果表明:该品种遗传性状稳定,田间生长整齐一致,田间长势强,耐肥性强,易烘烤;抗青枯病,中抗黑胫病和赤星病,中感根结线虫病、TMV、CMV 和PVY;烤后原烟颜色均匀,结构疏松,油分较足,色泽均匀鲜亮,主要化学成分含量适宜,比例协调,烟叶感官质量较好。多年试验结果表明,该品种产量、产值、均价、上等烟比例等均高于对照NC89,是一个品质、抗性、产量、适应性等方面较能兼顾的优良新品种。