二氧化硫对葡萄采后有机酸含量及苹果酸代谢途径的调控作用

为探究二氧化硫(sulfur dioxide,SO_2)对木纳格葡萄采后果实中有机酸含量及苹果酸代谢调控的影响。基于高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)测定果实贮藏过程中酒石酸、L-苹果酸、L-抗坏血酸和柠檬酸含量的变化,采用转录组测序(RNAsequencing,RNA-Seq)分析SO_2调控果实苹果酸代谢的主要途径。并通过测定苹果酸脱氢酶基因(malate dehydrogenase,MDH)、细胞质苹果酸脱氢酶基因(cytoplasmic malate dehydrogenase,cyt MDH)、线粒体苹果酸脱氢酶基因(mitochondrial malate dehydrogenase,mt MDH)、乳酸脱氢酶基因(L-lactate dehydrogenase,LDH)、NADP-苹果酸酶基因(NADP-dependent malic enzyme,NADP-ME)、丙酮酸脱羧酶1基因(pyruvate decarboxylase1,PDC1)、丙酮酸脱羧酶2基因(pyruvate decarboxylase2,PDC2)和乙醇脱氢酶基因(alcoholdehydrogenase,ADH)的表达差异性,进一步验证转录组测序的结果。结果表明:贮藏第60d,SO_2处理组果实中酒石酸、L-抗坏血酸和柠檬酸分别比CK组高0.13 mg/g、0.34 mg/100 g、0.02 mg/g;L-苹果酸比CK组低0.64 mg/g。SO_2可以维持木纳格葡萄果实中的酒石酸、L-抗坏血酸和柠檬酸含量,通过上调mt MDH、LDH、NADP-ME、PDC1和下调MDH、cyt MDH、PDC2、ADH的相对表达量,促进果实中L-苹果酸含量的分解,保持果实的风味特征。本研究为研究SO_2对鲜食葡萄采后果实有机酸代谢的调控作用提供理论依据。     

通气条件对曲霉N1-14'产生L-苹果酸的影响

报道了在曲霉 N1 -1 4' (Aspergillus sp.N1 -1 4' )利用葡萄糖产生 L-苹果酸已达80 g/ L的工艺条件下 ,进一步深入探讨通气条件对 L-苹果酸产生的影响。观察到曲霉 N1 -1 4' 产酸时对氧的需求是动态变化的 ,顺其自然则既能降低能耗又能提高产率 ;曲霉 N1 -1 4'对通气条件的改变非常敏感 ,改变通气条件 ,其胞质中可溶性蛋白含量及胞质中丙酮酸羧化酶活力均明显变化 ,而且 2者之间呈很好的线性正相关 (r=0 .9563 ) ,表明通气条件直接作用于催化 CO2 固定反应的酶 ,从而影响曲霉 N1 -1 4' 产生 L-苹果酸 ,提示应以丙酮酸羧化酶为指示对溶氧条件做进一步优化研究。     

基于代谢途径改造谷氨酸棒杆菌生产L-缬氨酸

L-缬氨酸是一种重要的支链氨基酸，随着市场对其需求量的不断提升，进一步提高L-缬氨酸的产量和糖酸转化率具有重要意义。在该研究中，使用实验室保藏的谷氨酸棒杆菌VHL-1作为出发菌株，通过对L-缬氨酸合成路径进行代谢改造显著提高了L-缬氨酸的产量和丙酮酸前体物的供应。首先，通过敲除ldh(编码乳酸脱氢酶)、poxB(编码丙酮酸氧化酶)、pyc(编码丙酮酸羧化酶)基因以及弱化alaT(编码丙氨酸转氨酶)基因表达来实现丙酮酸的富集。其次，通过强启动子P_tuf替换ilvBNC操纵子原始启动子并增加ilvBN(编码乙酰羟酸合酶)基因拷贝数来增强丙酮酸向L-缬氨酸合成的碳代谢流。最后，通过过表达支链氨基酸转运蛋白编码基因brnFE和调节蛋白编码基因lrp增强L-缬氨酸胞外输出效率。最终构建的重组菌株VHL-9在5 L生物反应器中进行补料分批培养，L-缬氨酸产量可到达(82.5±5.6) g/L,生产强度为1.15 g/(L·h),糖酸转化率为0.302 g/g葡萄糖。     

NCgl1221敲除和pyc过表达对谷氨酰胺发酵的影响

谷氨酰胺在生命活动中具有重要的作用,已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。谷氨酸是谷氨酰胺生物合成的前体物质,也是谷氨酰胺生产过程中最常见的副产物。研究发现,NCgl1221基因的编码蛋白是谷氨酸分泌的重要载体,丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌回补途径中的关键酶。为减少谷氨酰胺发酵过程中谷氨酸的积累量并提高谷氨酰胺产量,本研究利用同源重组技术敲除谷氨酰胺生产菌GM34的谷氨酸分泌载体编码基因NCgl1221,获得GM34ΔNCgl1221菌株;构建了丙酮酸羧化酶基因pyc过表达菌株GM34-pXMJ19pyc。5 L罐发酵实验表明,NCgl1221基因缺失可以使得谷氨酸积累量降低19.05%,过表达pyc基因使得谷氨酰胺产量和转化率分别提高5.54%和2.37%。可见,敲除NCgl1221、过表达pyc能够有效降低谷氨酸分泌并提高谷氨酰胺产量。     

增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成L-异亮氨酸的影响（英文）

该实验考察和比较增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成Lacterium glutamicum-异亮氨酸的影响。通过以L-异亮氨酸生产菌Corynebppc YI为出发菌株,分别采用基因组整合和质粒的方式过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因及丙酮酸羧化酶编码基因pyc。结果表明,获得pyc基因组整合和质粒过表达菌株ILE01和ILE02,摇瓶条件下菌株L-异亮氨酸产量分别提高17. 3%(6. 1 g/L)和9. 6%(5. 7 g/L)、发酵罐条件下分别提高11. L7%(24. 8 g/L)和8. 1%(24. 0 g/L)。获得ppc基因组整合和质粒过表达菌株ILE03和ILE04,摇瓶条件下菌株-异亮氨酸产量分别提高(30. 8%(6. 8 g/L)和13. 5%(5. 9 g/L)、发酵罐条件下分别提高15. 8%(25. 7 g/L)和9. 5%24. 3 g/L)。此外,过表达pyc和ppc还可不同程度地提高L-异亮氨酸转化率。然而采用质粒过表达pyc和ppc均使得菌株生物量下降。因此,过表达pyc和ppc均能显著提高L-异亮氨酸产量和转化率,基因组整合的过表达方式效果优于质粒...     

烘烤过程中中、上部烟叶苹果酸及相关酶活性研究

以K326的中部叶和上部叶为试验材料,研究了中、上部位烟叶在烘烤前、烘烤过程中关键温度点(38,42,48,54℃)及烘烤结束后苹果酸含量与苹果酸脱氢酶(MDH)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)及琥珀酸脱氢酶(SDH)活性的变化.结果表明:烘烤过程中,K326上、中部位烟叶的MDH活性均呈先升后降的变化趋势,且分别在42℃和48℃达到最大值;PEPC活性均呈先升后降再升的变化趋势,中部叶PEPC活性变化较上部叶平缓;SDH活性变化整体呈下降趋势,整个烘烤过程中,上部叶SDH活性极显著高于中部叶.K326中、上部位烟叶的苹果酸和总有机酸含量总体上均呈先升高后下降趋势.     

过表达L-赖氨酸合成途径关键基因和ε-聚赖氨酸合成酶基因对ε-聚赖氨酸合成的影响

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine, ε-PL)是小白链霉菌(Streptomyces albulus)产生的一种具有广谱抑菌活性的次级代谢产物,作为一种新型天然食品防腐剂在食品工业领域获得了广泛应用。通过代谢工程手段提高ε-PL生产菌的产物合成能力是降低ε-PL生产成本的有效手段,但目前关于ε-PL生物合成的关键代谢节点和调控机制还不清晰,因此还缺乏有效的靶基因。该研究基于文献挖掘了5个L-赖氨酸合成途径关键基因pyc(丙酮酸羧化酶基因)、ppc(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因)、zwf(6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因)、dapA(二氢吡啶二羧酸合成酶基因)、lysA(二氨基庚二酸脱羧酶基因)和1个ε-PL合成酶基因(pls),并借助基因过表达手段,寻找影响ε-PL生物合成的关键靶基因。研究结果发现,过表达ppc、pyc和pls能够有效促进S.albulus WG608合成ε-PL。在补料分批发酵方式下,过表达菌株OE-ppc、OE-pyc和OE-pls的ε-PL产量较出发菌株S.albulus WG608分别提高2.8%、9.9%和16.3%,单位菌体合成能力分别提高12.7%、2...     

丙酮酸羧化酶对酿酒酵母积累琥珀酸的作用探究

为探究丙酮酸羧化酶及微量元素Ca~(2+)和生物素对酿酒酵母积累琥珀酸的作用,敲除了琥珀酸脱氢酶编码基因(SDH2)并过量表达来自米根霉的丙酮酸羧化酶基因(Ro PYC)。琥珀酸产量由(0. 011±0. 002) g/L提高至(0. 841±0. 020) g/L,较表达前提高了75. 45%。随后,外源添加不同浓度Ca~(2+)和生物素考察其对琥珀酸发酵的影响,结果发现,Ca~(2+)的添加促进了菌体的生长但不利于琥珀酸的积累,而外源添加浓度为16、32、64、96μg/L生物素时,琥珀酸产量分别提高75. 04%、84. 26%、69. 28%、66. 79%。其中生物素质量浓度为32μg/L时,琥珀酸产量达到最大为(0. 964±0. 02) g/L,且丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase,PC)酶活提高14. 42%,说明PC酶活的提高促进了酿酒酵母中琥珀酸的积累。该研究为解决酿酒酵母琥珀酸合成过程中前体碳代谢流不足问题提供了新的解决思路。     

代谢工程改造Corynebacterium glutamicum生产L-苹果酸

以提高L-苹果酸的产量为目标,采用一次交换两次同源重组的方法,利用反向筛选标记,在敲除了丙酮酸醌氧化还原酶编码基因(pqo),丙酮酸脱氢酶编码基因(pdh)和乳酸脱氢酶编码基因(lldh)的C.glutamicumΔpqoΔpdhΔlldh(C.glutamicumΔPPL)基础上,无痕敲除了L-苹果酸积累支流代谢途径的2个关键酶基因:苹果酸醌氧化还原酶编码基因(mqo)和苹果酸酶编码基因(male),同时敲入了苹果酸分泌转运蛋白基因(transb),获得了产L-苹果酸的工程菌株;采用高效液相色谱法检测了工程菌株C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的发酵产物。实验结果表明:C.glutamicum ATCC 13032发酵后不积累L-苹果酸,而工程菌C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale发酵48 h,积累了12.8 g/L的L-苹果酸,工程菌的糖酸转化率为33.18%,为利用C.glutamicum ATCC 13032发酵生产L-苹果酸提供了基础遗传资源。     

Actinobacillus succinogenes 130Z高产丁二酸突变菌株的发酵性能和代谢通量比较研究

以丁二酸产生菌为出发菌株,利用紫外线诱变,经氟乙酸、丙烯醇筛选突变株,并对相关酶活性、代谢通量进行研究。结果表明：氟乙酸诱变株的苹果酸脱氢酶活力增加159.2%;氟乙酸- 丙烯醇复合诱变株乙醇脱氢酶的活力下降78.0%,而苹果酸脱氢酶及丙酮酸羧化酶的活力分别提高165.8% 和1226.4%。原始菌株的葡萄糖利用率很低,100g 糖产47.0g 丁二酸,氟乙酸- 丙烯醇抗性菌株利用100g 葡萄糖产58.8g 产物,糖转化率提高25%。经过诱变筛选以后,丁二酸产量达到58.8g/L。     

大肠杆菌苹果酸脱氢酶基因mdh的克隆、高效表达及酶学性质

以大肠杆菌基因组DNA为模板,扩增得到苹果酸脱氢酶(mdh)编码基因mdh,构建了重组菌pET-28a-mdh/BL21并成功表达了mdh,大小约36 000。选用Ni柱亲和层析法纯化具有活性的苹果酸脱氢酶(mdh),纯化后比酶活达到112.5 U/mg,纯化倍数达2.62倍,回收率为59%。并对该酶的酶学性质进行了初步研究,其中反应最适pH值为6.0,在pH值2.0~6.0范围内稳定;反应最适温度为37℃,在42℃以下酶的稳定性较好。K+对酶有明显的激活作用,Cu2+对酶有抑制作用,Hg2+和Zn2+对酶有很强的抑制作用。醇类对酶的活力影响不大,丙三醇可显著提高酶的热稳定性。酶动力学参数以草酰乙酸为底物的Km为0.235 mmol/L,Vmax为0.47μmol/(L.min)。     

利用玉米芯水解液产苹果酸的戴尔根霉突变菌株选育及代谢分析

诱变筛选发酵玉米芯水解液高产苹果酸的根霉属菌株,并对其进行代谢分析,研究其高产苹果酸的机理。对分离得到的菌株进行ITS序列鉴定,进一步利用软X射线辐射对菌种进行诱变筛选、对出发菌株和突变菌株的相关酶活力进行测定及代谢通量分析。利用软X射线辐射结合丙烯醇平板筛选乙醇脱氢酶缺陷型菌株,得到突变株-1,发现其乙醇脱氢酶基因的3 处密码子突变为“TAA”,阻断了突变菌株的乙醇代谢途径。进而利用软X射线辐射结合氟乙酸平板筛选乙醛酸循环缺陷型菌株,得到复合突变株-2,降低了副产物富马酸及琥珀酸的产量。复合突变株-2的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶中几处NADP（H）结合位点发生突变,增加了糖酵解和磷酸戊糖两种途径的相互作用,促进了其戊糖代谢。经过两步分离筛选,得到的复合突变株-2能发酵玉米芯水解液高产苹果酸,且减少了副产物乙醇、富马酸、琥珀酸的生成。复合突变株-2的苹果酸产量占代谢物总产量的比例由出发菌株的71%增加到91%,苹果酸产量增大1 倍,研究成果对工业化利用突变菌株生产苹果酸具有重要意义。     

谷氨酸棒杆菌代谢副产物对α-酮戊二酸积累的影响

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中ldh基因编码乳酸脱氢酶,可以催化丙酮酸转化生成乳酸,ackA和pqo基因编码乙酸激酶和丙酮酸:醌氧化还原酶,可以催化丙酮酸转化为乙酸.为了研究这三个基因缺失对谷氨酸棒杆菌α-酮戊二酸积累的影响,以Cglutamic um GDK-10为出发菌株,通过重叠延伸PCR及同源重组技术分别构建ldh,pqo,ackA,pqo和ackA基因缺失突变株GDK-14,GDK-15,GDK-16,GDK-17.对出发菌及上述重组菌株进行发酵验证比较,发酵结果表明:ldh和pqo基因缺失菌株的α--酮戊二酸产量分别比出发菌降低了8.54％和27.9％,而ackA基因的缺失使α-酮戊二酸产量比出发菌提高了8.99％.     

代谢工程改造酿酒酵母生产L-苹果酸

为了研究胞质还原路径对酿酒酵母积累L-苹果酸的影响,通过在酿酒酵母中过量表达源于黄曲霉的丙酮酸羧化酶(Afpyc)、苹果酸脱氢酶(Afmdh)及C4-二羧酸转运蛋白(Afmae),成功构建了L-苹果酸合成的胞质还原路径。结果表明:(1)当低水平表达Afpyc时,其丙酮酸浓度降低了42%,但不能积累L-苹果酸;(2)当共表达Afpyc和Afmdh时,菌株W005积累了1.93 g/L的L-苹果酸,与对照菌株W004相比细胞干重提高了350%,丙酮酸降低了65.9%;(3)当共表达Afpyc、Afmdh和Afmae时,菌株W006的L-苹果酸产量提高了21.2%,达到2.34 g/L;4)通过提高接种量至初始OD_(600)=2,L-苹果酸的产量提高到3.28 g/L。通过在酿酒酵母中过量表达黄曲霉胞质还原路径的关键基因,使得工程菌能够积累L-苹果酸,为目标产物的高效积累提供了一种可借鉴的思路。     

烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆与生物信息学分析

利用同源克隆和电子克隆方法,从烤烟栽培品种韭菜坪2号(Nicotiana tobacum cul.Jiucaiping2)中克隆获得烤烟ζ-胡萝卜素脱氢酶(zeta-carotene desaturase,ZDS)基因的全长cDNA序列(命名为T-zds1),并对其编码蛋白的一级、二级进行了预测。该基因在GenBank中的登录号为JF975566,全长为2312 bp,编码的蛋白含588个氨基酸,蛋白登录号AEG73891。BLASTp搜索结果及进化分析结果表明,烤烟T-zds1基因编码氨基酸序列与番茄、向日葵、胡萝卜ZDS基因编码氨基酸序列的相似性分别为97%,92%,90%。     

YDL080C和LEU2基因敲除对工业黄酒酵母异戊醇生成量的影响

通过敲除生成途径中关键酶的编码基因,对异戊醇在工业黄酒酵母N85中的生成进行了研究。采用融合PCR技术,分别构建类丙酮酸脱羧酶基因(YDL080C)缺失组件"YDL080C-URA3-YDL080C"和β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(LEU2)缺失组件"LEU2-URA3-LEU2",转化工业黄酒酵母N85尿嘧啶缺陷型单倍体Na-u(MATa ura3),获得单倍体工程菌Na-y和Na-l。将转化子与亲本分别进行实验室规模的黄酒发酵实验,结果 YDL080C缺失工程菌的异戊醇含量与亲本相比没有明显变化,说明类丙酮酸脱羧酶不是该途径关键酶;LEU2缺失工程菌的异戊醇含量降低16.16%,说明糖代谢途径存在,但只占小部分,而其他理化指标无明显差异。     

优化简并引物PCR克隆Candida glycerinogenes 3-磷酸甘油脱氢酶基因片段

为了从工业生产菌株耐高渗产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)克隆甘油合成的限速酶编码基因胞浆NAD -3-磷酸甘油脱氢酶基因(ctGPD),对不同酵母和其他真核生物的NAD -3-磷酸甘油脱氢酶进行比对,分析氨基酸和核苷酸的保守序列,设计了4对简并引物用于扩增C.glycerinogenes的NAD -3-磷酸甘油脱氢酶(GPD)基因片段,经过优化PCR反应条件,利用其中一对中等简并度的引物扩增出CgGPI)基因中约600 bp的保守核心片段.DNA序列及推绎的氨基酸序列进行比对分析表明,该基因片段与其他酵母的胞浆NAD -3-磷酸甘油脱氢酶基因的对应区域具有典型的保守区域,并且与安格斯毕赤酵母的GPI)基因相似性较高.     

利用TAIL-PCR克隆Gluconobacter suboxydans葡萄糖脱氢酶基因及其生物信息学分析

以Gluconobacter suboxydans J菌株基因组DNA为模板,基于吡咯喹啉醌附着位点的保守区域设计引物,通过交错式热不对称PCR获得编码葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase,GDH）的全长基因（gdh）,并对其序列进行生物信息学分析。结果表明：gdh基因全长2 268 bp,编码755个氨基酸,其蛋白序列与Gluconobacter属的GDH具有较高的同源性。GDH的分子质量约为81.72 ku,pI值约为5.14;GDH蛋白的二级结构由18.41%的α-螺旋、16.16%的延伸和65.43%的无规则卷曲3种结构模块组成;GDH N末端的AA 1～140区域有5个跨膜结构域。     

过表达乙酰-CoA相关基因提高出芽短梗霉liamocins合成能力

为提高出芽短梗霉liamocins合成能力,分别过表达了出芽短梗霉P30的乙酰-CoA合成相关基因,包括乙酰-CoA合酶编码基因(ACS1)、ATP-依赖性柠檬酸裂解酶编码基因(ACL)、苹果酸酶编码基因(ME)、丙酮酸羧化酶编码基因(PYC1)。重组菌株的liamocins产量分别提高了8.19%、93.74%、13.49%和17.12%,其中过表达ACL的提升效果最为明显,但该基因的转录水平仅提高了0.94倍,这说明ACL为出芽短梗霉P30合成liamocins的关键基因,liamocins合成的能力或许受ACL转录水平的限制。结果表明,强化乙酰-CoA合成可以提高liamocins产量,而其中的ACL基因对其合成至关重要。研究为解决liamocins合成过程中碳代谢流前体不足问题提供了解决思路。     

基于基因转录和代谢物分析的异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌YILW的理性改造（英文）

为获得异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)YILW的理性改造策略,考察该菌株与出发菌株C.glutamicum ATCC 13032异亮氨酸合成途径中关键酶及代谢产物的差异。结果表明,C.glutamicum YILW丙酮酸羧化酶编码基因pyc的下调表达使得其胞内草酰乙酸含量降低,过表达该基因显著增加胞内草酰乙酸含量及异亮氨酸产量(分别从1.32μmol/g(细胞干质量,下同)和5.18 g/L提高至3.32μmol/g和5.81 g/L),但副产物赖氨酸及胞内2-酮丁酸积累量提高。针对该问题采用强启动子替换手段过表达ilv BNC操纵子,使得其异亮氨酸产量提高至6.63 g/L。为进一步增加异亮氨酸合成,过表达输出载体编码基因brn E和brn F,其产量提高至7.31 g/L,较出发菌株C.glutamicum YILW提高41.1%,转化率提高40.0%。由此可见,在基因转录及代谢物分析结果指导下理性过表达pyc、ilv BNC操纵子及brn E和brn F能够显著提高异亮氨酸产量并降低副产物浓度。