水牛胎儿成纤维细胞电转染条件的优化

高活力的转基因细胞的制备是转基因克隆动物研究的关键环节。为了高效制备转基因细胞,外源基因转入水牛胎儿成纤维细胞的条件需要优化。采用组织块贴壁法分离获得水牛胎儿成纤维细胞,经染色体核型分析表明获得的细胞具有正常的生物学功能,可用于细胞转染。采用电穿孔法将载体EGFP-N1导入水牛胎儿成纤维细胞,分别比较不同电压(200V,250V,300V,350V)、不同电击时间(5ms,10ms,15ms)和不同细胞代数(第3代、第5代、第10代)的转染效率,并利用优化的电转染条件将乳腺特异性表达的水牛促乳素(PRL)基因导入水牛胎儿成纤维细胞,G418筛选获单克隆并进行鉴定。结果发现电压为300 V,脉冲时间为10 ms时,细胞GFP阳性率为35.5%,转染效率较高。随传代次数的增加,细胞的转染效率下降;传至第10代的细胞转染效率显著低于第3代的水牛胎儿成纤维细胞(30%VS 35.5%,P<0.05)。运用优化条件转染、筛选可获得转PRL单克隆细胞,转染效率为2.1×10-5(84/4×106)。挑取单克隆细胞扩大培养,经PCR鉴定和核型分析,证实单克隆稳定整合促乳素基因,并且核型分析正常,可作为核供体,用于生产水牛转基因克隆胚胎。为采用体细胞克隆技术生产水牛转基因胚胎奠定了基础。     

IK4基因突变体与其逆转录病毒载体的构建及在白血病细胞中的表达

对造血调控中发挥重要作用的IKAROS基因亚型IK4进行突变,并构建重组逆转录病毒表达载体及使其在白血病细胞中表达。采用重叠延伸PCR定点突变技术,成功构建了4个IK4单突变或多突变突变体。将这4个突变体克隆至Pmscvpuro逆转录病毒载体中,构建重组蛋白表达载体。基因测序验证突变序列正确后,将重组逆转录病毒载体与病毒包装质粒VSVG、Gag-Pol共同感染293T细胞,过滤收集病毒上清,将病毒上清转染白血病NB4细胞。用Puromycin对细胞进行筛选,并通过Western印迹法对突变体表达细胞系进行验证。通过重叠延伸PCR法成功构建了4个IK4的定点单突变和定点多突变体,利用逆转录病毒介导的转染方法使IK4的4个突变体在白血病细胞中成功稳定表达,为后续的功能和机制的研究奠定了基础。     

重组人成纤维细胞生长因子8b原核表达载体的构建和纯化研究

成纤维细胞生长因子8b(fibroblast growth factor,FGF8b)在生长因子中与内分泌癌的发生和发展相关联,是一个有潜在临床应用价值的候选分子,为了满足重组人FGF8b的研发需要,论文采用分子克隆的方法构建了以包涵体形式表达FGF8b的重组大肠杆菌,并初步摸索出包涵体蛋白的纯化和复性工艺条件,通过Western blot和MTT法鉴定了FGF8b的生物化学特征和促增殖活性,表明利用包涵体复性技术初步得到了具有活性的蛋白,为后续研发进程奠定了基础。     

稳定表达人FcγRⅡA的HEK 293T细胞系的建立及其功能鉴定

构建稳定表达FcγRⅡA(CD32a)的人胚肾293T细胞系及其相应的对照细胞系FcγRⅡB(CD32b),FcγRⅡA(Y288F/Y304F)[(CD32a(Y288F/Y304F)],作为进一步研究FcγRⅡA介导的信号通路的基础。首先,从人外周血单核细胞cDNA中扩增CD32a和CD32b,并构建pMSCVegfp-CD32a及pMSCVegfp-CD32b逆转录病毒表达载体。另外,将构建成功的pMSCVegfpCD32a288和304位点的酪氨酸(Y)突变成苯丙氨酸(F),得到pMSCVegfp-CD32a(Y288F/Y304F)表达载体。构建成功的逆转录病毒载体经酶切、测序鉴定后,与pcl-amp辅助载体共同转染HEK 293T细胞进行病毒包装。病毒感染HEK 293T细胞后通过流式分选得到稳定表达CD32a、CD32b、CD32a(Y288F/Y304F)的HEK 293T细胞系,流式检测各细胞株膜表面的CD32分子表达及白色念珠菌考察各细胞株抗体依赖的内吞作用。结果表明:稳定表达CD32a、CD32b、CD32a(Y288F/Y304F)的HEK293T细胞纯度在98%以上,并且膜表面均可检测到CD32的表达。吞噬实验结果表明,HEK 293T-CD32a细胞呈现对白色念珠菌的吞噬作用,而HEK 293T-CD32b、HEK 293T-CD32a(Y288F/Y304F)无吞噬作用。     

血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子与血管瘤关系的研究进展

血管形成因子在血管瘤病理演变过程中起重要作用.血管形成因子很多,包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、血管生长素(angiogenin)、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、α-肿瘤坏死因子(TNF-α)、血小板衍生生长因子(PDGF)、粒系-集落刺激因子(G-CSF)、白介素-8(IL-8)、增殖素(proliferin)、干细胞生长因子(HGF)、调理素(pleiotropin)以及雌二醇(estradiol),低分子量者包括烟酰胺、吡啶和腺苷.目前研究最多且与血管瘤关系最密切的血管形成因子是VEGF和FGF[1-2].下面对VEGF及FGF在血管瘤中的研究现状及进展进行综述.     

成纤维细胞生长因子受体1在非小细胞肺癌中的研究进展

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)已成为全世界癌症患者死亡的主要原因之一,其治疗成为目前研究热点。但NSCLC中成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGFR)基因突变以及间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)融合基因发生率低,相应靶向药物治疗的总体效果并不理想。FGFR1作为NSCLC中较常见的异常基因,其异常扩增高表达与多种肿瘤的发生发展相关,同时发现多种相关的分子靶向药物对肿瘤有抑制作用。本文对FGFR1在NSCLC中的扩增高表达情况、其与NSCLC临床特点之间的关系以及目前相关靶向药物治疗研究进展作一综述。     

通阳化浊法对动脉粥样硬化大鼠VEGF、VEGFR和bFGF表达的影响

目的:观察通阳化浊法对动脉粥样硬化大鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)表达的影响。方法:制备动脉粥样硬化大鼠模型,随机分为通阳宽胸颗粒组、辛伐他汀组、通阳宽胸颗粒+辛伐他汀组、模型组和空白对照组,给予相应药物治疗8周后,检测斑块面积和VEGF、VEGFR及b FGF的表达。结果:1与空白对照组比较,模型组的斑块面积、VEGF、VEGFR和b FGF表达均显著增高(P<0.05);2与模型组相比,所有药物治疗组的斑块面积、VEGF、VEGFR和b FGF表达均显著降低(P<0.05),通阳宽胸颗粒+辛伐他汀组降低更明显;3VEGF、VEGFR和b FGF表达与斑块面积正相关。结论:通阳化浊法可有效抑制动脉粥样硬化中VEGF、VEGFR和b FGF的表达、缩小斑块的面积,尤其是与他汀类药物结合时,效果更显著。     

人组氨酸磷酸酶蛋白PHP14的过表达及其对NIH-3T3细胞体外增殖和非锚定依赖性生长的影响

目的:获取人组氨酸磷酸酶蛋白PHP14基因,并构建其N端和C端GFP融合的真核表达载体,建立过表达PHP14的NIH-3T3细胞系,并观察其对NIH-3T3细胞体外增殖和非锚定依赖性生长的影响。方法:以HeLa cDNA为模板,PCR扩增PHP14的全长编码基因,分别克隆到pEGFP-N2和pEGFP-C3载体中,构建pEGFP-N2-PHP14和pEGFP-C3-PHP14真核表达载体,利用脂质体将构建的载体转染到NIH-3T3细胞中,MTT法检测细胞增殖,软琼脂成集落法检测体外非锚定依赖性生长能力。结果:成功构建了过表达PHP14的真核表达载体pEGFP-N2-PHP14和pEGFP-C3-PHP14,并在NIH-3T3细胞中检测到了目的基因的过表达,PHP14在NIH-3T3细胞中过表达并不影响NIH-3T3细胞的体外增殖,但赋予了NIH-3T3细胞非锚定依赖性生长的能力。结论:成功构建了过表达PHP14的NIH-3T3细胞模型,在NIH-3T3细胞中过表达PHP14并不影响NIH-3T3细胞的体外增殖,但赋予了NIH-3T3细胞非锚定依赖性生长能力。     

骆驼蓬脂转移蛋白基因真核表达载体的构建及其体内外抗瘤效应的研究

目的:构建骆驼蓬脂转移蛋白(lipid transfer protein from Peganum harmala,PhLTP)基因真核表达质粒,并探讨其对黑色素瘤B16细胞在体内外的抗肿瘤作用。方法:将PhLTP基因亚克隆至pcDNA3.1上,获得重组质粒pcDNA3.1-PhLTP;用脂质体转染法将重组质粒及空载体外转染B16细胞,MTT检测其对B16细胞生长的影响。建立B16荷瘤小鼠模型,设重组质粒(pcDNA3.1-PhLTP)、空载(pcDNA3.1)、生理盐水和阳性药物(CTX)组,分别处理小鼠后测量各组肿瘤体积并称瘤重,计算抑瘤率。光镜观察鼠脾、肝等组织变化;免疫组织化学法检测各瘤体中PhLTP、血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达。结果:pcDNA3.1-PhLTP转染B16细胞72 h后,细胞增殖能力明显受到抑制(P<0.01)。注射pcDNA3.1-PhLTP组的小鼠肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积小于空载和生理盐水组(P<0.05)。显微镜下可见重组质粒组肿瘤细胞有不同程度的点、片状坏死,而肝、肺等无明显病理损伤。重组质粒组肿瘤组织中有PhLTP蛋白的表达,且VEGF和bFGF的阳性表达指数都低于空载和生理盐水组(P<0.01)。结论:成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-PhLTP,体内外实验结果显示其能有效地抑制B16细胞的生长,预示了该重组质粒在治疗黑色素瘤中的潜在应用价值。     

PRMT2慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建精氨酸甲基转移酶2(PRMT2)慢病毒表达载体。方法通过PCR扩增PRMT2 c DNA,将PRMT2 c DNA连接于GV308载体,经测序确认后,将GV308/PRMT2与p Helper 1.0和p Helper 2.0共转染至293T细胞中,收获病毒,通过Real time PCR测定滴度;将PRMT2慢病毒表达载体侵染293T细胞,通过四环素诱导和Western blot检测PRMT2慢病毒表达载体的表达能力。结果在感染PRMT2慢病毒载体293T细胞中能检测到PRMT2-3Flag融合蛋白的表达。结论成功构建PRMT2的慢病毒表达载体。     

钢铁企业PM_(2.5)污染情况分析及防控措施研究

介绍了PM2.5概念、组成、来源及危害,从太原市的地形、地貌、气象特征对PM2.5的影响方面进行了论述,对钢铁企业排放PM2.5的主要工序进行了分析,并针对太钢当前PM2.5的防控措施提出了一些建议。     

中国土建类专业评估认证与注册师制度回顾与思考

专业评估认证已成为教育界和关心教育人士议论的热门话题之一。土建类专业评估认证是中国开展得最早的专业评估认证,有近20年的专业评估认证的经验。文章分析了中国土建类专业评估认证的基本情况、中国建设行业注册师制度情况、对专业评估认证及注册师制度的思考,以及完善建设行业注册师制度的建议。     

特雷克斯(Terex)主要并购整合历程与成就研究

特雷克斯是一家经营方式独特的跨国公司,1986年创建于美国特拉华州.凭借其独特的收购兼并经营方式,在工程机械领域迅速扩张,不断将世界各地有名的单一工程机械品种生产商整合在自己的品牌下.     

基于城乡一体的规划和管理的转型及重构——南京浦口地区规划实践和探索

2008年1月1日开始实施的《中华人民共和国城乡规划法》,建立了由城镇体系规划、城市规划、镇规划、乡规划和村庄规划构成的我国法定城乡规划体系,标志着我国城乡规划在法律制度上迈上了一个新台阶.新的城乡规划法,打破了长期存在的城乡二元分治情况,加强城乡统一规划管理,促进了城乡经济社会全面协调可持续发展.但同时它仅仅只是解决了城市和村镇的统一规划问题,对于存在于乡村地区的大量的自然,历史等资源的规划和保护,利用的问题,并没有纳入统一规划和管理,本文通过结合南京浦口的规划实践工作,提出基于城乡一体的规划编制设想,目的旨在探索地方层面的规划编制如何能进一步结合地区管理需要,实现规划与管理的无缝对接,充实和完善城乡规划体系.     

小城镇发展与水土流失治理

建设与发展小城镇,其目的在于集中人口、控制人口、改善环境、发展经济、增强国力。实现人口控制、资源开发、环境保护协调发展。中国要发展,环境要改善,国民素质要提高,农村人口(特别是山区人口)必须聚集。小城镇的建设与发展是农业工业化、农村城市化的必然趋势,结合国家大力发展小城镇的契机,利用小城镇的建设聚集农村和山区人口,做好区域内水土流失治理具有现实意义和长远意义。     

无阀滤池在丁腈橡胶污水处理中的应用

采用GIS技术、GPRS技术及物联网传感等技术实现对城区"雨情"实时发布、"涝情"及时预警、"排涝"资源科学调度.并结合WebGIS地理技术设计和大型应用数据库系统,在此基础之上,对各种信息资源进行全面的整合和重组.本系统在东营市上线运行以来,对大、暴雨监测,多次利用排水模型进行预警,针对实时降雨强度进行报警,通过短信、LED显示大屏等多种渠道对广大市民进行提醒,对人民大众出行和生产带来了很大的方便和指导意义.     

BIM在机电安装施工管理中的应用和探索

BIM技术可以实现各专业的协同设计,可在机电安装项目中,模拟所有管线的综合排布位置和工序,并进行施工模拟,为工程实际安装阶段的工作提供更有价值的信息。该文从机电安装的角度,结合实际案例,在机电综合排布、碰撞检查等方面的应用进行了阐述,验证BIM技术在机电安装施工管理中的作用,并对BIM技术对安装工业化进程的推动作用进行了探讨。     

浅析城市市政给排水规划设计的研究与分析

在现实生活中,因为各种原因的限制以及约束,导致城市给排水规划设计存在一些没解决的问题,需要得到进一步的改善。本文首先介绍了城市市政给排水设计的一些背景,然后阐述了设计中应考虑的几点问题,希望能为同行提供一些帮助。     

我国历史文化名城名镇名村保护的回顾和展望

回顾1982年以来30年我国历史文化名城名镇名村保护发展历程,初步分为历史文化名域保护兴起、历史文化街区深入保护、历史文化名城名镇名村全面保护3个阶段.从历史文化名域名镇名村评选评价、保护体系、保护规划等方面探讨了一些概念和方法问题,并对我国今后的历史文化名域名镇名村保护提出了工作和研究建议.     

榫卯的繁简和大小

在古时候,支撑起一栋楼房的是木材,而木材与木材相连接固定的方法,就是榫卯.古时候的木匠,技艺精湛,手艺超群,在没有任何图纸的情况下,可以把楼房建造起来而不倒塌.一根根木材靠着木匠做出的榫卯搭接在一起,最后形成了亭台楼阁.榫卯作为木材和木材之间的连接点、固定点,不仅扮演着结构的角色,也扮演着美观的角色.其质量好坏直接关系到建筑的优劣,榫卯是建筑的重要组成部分,其审美功能不容忽视,它不但能体现建筑的个性和特色,还能增添建筑的美观.文章主要通过研究中国古建筑各个地方的榫卯,结合观察法、现场调研法、文献阅读法、经验总结法,分析探讨榫卯的繁简、大小与构件的承重有何种关系,得出结论并运用于毕业设计当中.