乳酸片球菌素Ped-A基因表达载体的构建

乳酸片球菌素可以作为防腐剂延长食品的保鲜期,为研究和开发可食用级别的防腐剂,将乳酸片球菌素结构基因Ped-A全长和不含信号肽的序列克隆至乳酸菌表达载体p MG36e和p NZ8048,经酶切鉴定及序列分析,所转化的大肠杆菌DH5α和DHB4中含有插入Ped-A基因全长和不含信号肽的序列的重组质粒。结果表明,成功构建了乳酸片球菌素Ped-A基因的乳酸菌表达载体p MG36e/Ped-A(全长/片段)、p NZ8048/Ped-A(全长/片段)。     

溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究

根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(p KLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K.lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K.lactis GG799/p KLAC1-Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8 000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖和NH_4NO_3可提高酶比活性,最适表达p H为7.0~7.5,最适反应p H为7.0~8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,p H 3~6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr~(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Ba~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的抑制作用。     

人金属硫蛋白在乳酸菌中的融合表达及其预防食源性镉污染的应用

目的:镉(Cd)是一种重要的环境污染物,其具有半衰期长、不能生物降解等特性使之易于在人体重要脏器中蓄积并对人身体健康造成不可逆的损伤。为此,减少镉的摄入,尤其是经胃肠道,是预防人体慢性镉中毒的有效方法。方法:构建以α-半乳糖苷酶作为筛选标记、表达金属硫蛋白融合蛋白(GST-SUMO-MT)的重组乳酸乳球菌MG1363/p M-GSMT。原子吸收光谱法分析重组乳酸菌对Cd~(2+)和Zn~+的结合能力。以灌胃方式,对雄性Sprague-Dawley大鼠每天口服不同剂量的重组乳酸菌(2×10~9~2×10~(11)CFU/d)及CdCl_2溶液[5mg/(kg·d)],连续处理56天。收集实验动物肝、肾、脑及睾丸,利用原子吸收光谱法检测这些脏器中镉离子的含量。生化分析检测血清中尿素及丙氨酸转氨酶的含量。石蜡切片及苏木精-伊红染色分析各组织的病理变化。结果:获得不含抗生素抗性的重组乳酸菌MG1363/p M-GSMT,其吸附Cd~(2+)、Zn~(2+)能力比对照组分别提高3.52倍和1.60倍。动物实验结果显示,镉能在肝、肾、脑及睾丸中蓄积,并对这些器官造成明显的病理损伤。原子吸收光谱分析、血清生化指标及病理切片结果都显示,重组乳酸菌能有效降低胃肠道中镉的摄入,进而减少Cd~(2+)在各脏器中的蓄积及对器官功能的损伤。结论:为预防人体食源性慢性镉中毒提供了一种有效的生物材料和使用方法。     

(1,3)-β-D葡聚糖检测在恶性血液病患者侵袭性真菌病早期诊断中的临床价值

目的:探讨采用(1,3)-β-D葡聚糖对于临床诊断恶性血液病患者侵袭性真菌病(IFD)的价值。方法:选择2013年2月-2015年1月本院收治的确诊或疑似IFD恶性血液病患者80例作为研究对象,检测并比较不同诊断标准下(1,3)-β-D葡聚糖水平及其敏感性、特异性。结果:不同诊断标准下,血浆(1,3)-β-D葡聚糖水平阳性检测率分别为72.50%、87.50%,比较差异有统计学意义(P<0.05);以≥60 pg/m L为阳性标准时其敏感性、阴性预测值比≥80 pg/m L为阳性标准时明显要高,差异有统计学意义(P<0.05);而两种标准下试验的特异性、阳性预测值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:实施(1,3)-β-D葡聚糖检测可以对IFD患者予以早期诊断,临床推广意义重大。     

S-2-氯丙酸脱卤酶在毕赤酵母中的重组表达

根据S-2-氯丙酸脱卤酶的基因序列设计引物,克隆重组大肠杆菌中的S-2-氯丙酸脱卤酶基因。将目的基因片段构建到pPIC9K载体,经Sac I单酶切后转化到毕赤酵母GS115中,通过G418抗性YPD平板筛选高拷贝重组子,甲醇诱导成功实现胞外活性表达。重点考察了基因拷贝数和甲醇浓度的影响,结果表明重组子含有12个拷贝,甲醇浓度为1%时较佳,重组脱卤酶的酶活可达236U/L。重组毕赤酵母具有很好的遗传稳定性。对该酶最适反应温度及pH进行研究,表明其最适反应温度为50℃,最适pH为9.5。     

重组半胱氨酸脱巯基酶AtLCD的表达、纯化及酶学性质

目的:在重组大肠杆菌中表达重组拟南芥L-半胱氨酸脱巯基酶AtLCD(H2S内源产生关键酶),确定最佳诱导表达和纯化条件,并研究重组酶的酶学性质。方法:对大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-LCD进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养,将纯化的目的蛋白AtLCD进行酶学性质的研究。结果:重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.1 mmol/L IPTG,30℃诱导3 h。500mmol/L的咪唑洗脱Ni柱可得较纯的目的蛋白。重组酶性质研究结果表明,酶的最适pH为9.5,最适作用温度为37℃,最适条件下的以L-Cys为底物的米氏常数(Km)为1.572 mmol/L,Vmax为1.52 nmol/mg·min。金属离子Mg2+,Fe3+和EDTA对重组酶的活性有一定的抑制作用,Ba2+、Ca2+和Co2+在一定程度上提高了酶的活性,其中Co2+效果更强。蛋白变性剂SDS和酶抑制剂羟胺也不同程度地抑制了酶的活性。结论:明确了重组AtLCD的酶学性质和最佳诱导表达及纯化条件,为该LCD的深入研究和气体信号分子H2S在植物应答逆境胁迫机制的研究奠定了基础。     

兔肌3-磷酸甘油脱氢酶的提纯及性质研究

目的:研究兔肌3-磷酸甘油脱氢酶的分离纯化方法及其酶学性质,为测定血清甘油三酯所用酶联试剂的开发提供试验基础和理论依据。方法:通过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose、Blue-Sepharose和羟磷灰石纯化兔肌3-磷酸甘油脱氢酶,利用凝胶过滤和梯度PAGE(5%～15%)法测定酶分子量,采用常规酶学动力学分析方法,考察pH、温度、底物浓度以及部分金属离子与有机化合物对酶促反应的影响。结果纯化后的兔肌3-磷酸甘油脱氢酶经PAGE(12%)分析为单一条带;酶分子量为115～122 kDa;酶最适温度45℃,最适pH 9;酸碱稳定范围pH6～9,低于45℃时热稳定性好;最适条件下,以3-磷酸甘油和NAD+为底物,测得酶的Km分别为7.4×10-3mol/L和1.47×10-4mol/L;Ba2+、Mn2+、Fe2+、Al3+、Cu2+、Ni2+、Ag+、Hg2+、NaN3、EDTA对酶有不同程度的抑制作用,Mg2+、Ca2+、Co2+、Zn2+有一定程度的激活作用,其中Co2+和Zn2+对酶的激活作用能达到200%以上,有机化合物NaF对酶的活性没有影响。     

一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶(Nm LEH)通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21 (DE3)宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0. 5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高(0. 45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组Nm LEH蛋白;对Nm LEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH为7. 5,在pH 7. 0～9. 0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明Nm LEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的微生物降解规律

从北京某污水厂驯化的活性污泥中分离得到邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)的降解菌X,该菌在好氧条件下能以DEHP为唯一的碳源和能源.对其降解10 mg/L DEHP的性能进行了研究,考察了不同pH值、不同菌液初始浓度、不同DEHP初始浓度以及不同降解时间下菌株X对DEHP的降解效果.结果发现:菌株X降解DEHP的最适pH值为6.0左右;DEHP初始浓度和菌液初始浓度存在一个合理的比值,在这一比值下对DEHP的降解率最高;DEHP的降解过程符合指数关系,其半衰期为10 h,36 h后降解率可达到99%.     

一种海洋来源蜡样芽孢杆菌α-半乳糖苷酶基因的克隆表达及功能鉴定

为获得高效的α-半乳糖苷酶并了解其功能,采用基因工程技术,从鹿角菜中筛选获得的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus中克隆得到一个新的α-半乳糖苷酶基因(BcgalA),并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功进行了重组表达。结果表明:BcgalA基因序列编码441个氨基酸,预测的BcGalA蛋白相对分子质量约为50 380,生物信息学分析显示,该酶属于GH4家族;酶活试验表明,在37℃、pH 8.0条件下该酶水解4-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(pNP-α-Gal)、棉子糖的比活力分别为(1.498±0.034)、(0.261±0.012)U/mg,但对半乳甘露聚糖无水解活性。研究表明,本研究中克隆表达的BcGalA是一种属于GH4中仅对低分子量底物起作用的α-半乳糖苷酶,为探究GH4α-半乳糖苷酶的结构与功能关系提供了样本。     

一种海洋来源蜡样芽孢杆菌α-半乳糖苷酶基因的克隆表达及功能鉴定

为获得高效的α-半乳糖苷酶并了解其功能,采用基因工程技术,从鹿角菜中筛选获得的蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus中克隆得到一个新的α-半乳糖苷酶基因(BcgalA),并在Escherichia coli BL21(DE3)中成功进行了重组表达。结果表明:BcgalA基因序列编码441个氨基酸,预测的BcGalA蛋白相对分子质量约为50 380,生物信息学分析显示,该酶属于GH4家族;酶活试验表明,在37℃、pH 8.0条件下该酶水解4-硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(pNP-α-Gal)、棉子糖的比活力分别为(1.498±0.034)、(0.261±0.012)U/mg,但对半乳甘露聚糖无水解活性。研究表明,本研究中克隆表达的BcGalA是一种属于GH4中仅对低分子量底物起作用的α-半乳糖苷酶,为探究GH4α-半乳糖苷酶的结构与功能关系提供了样本。     

抗生素废水高效降解菌的筛选及其作用条件优化

为更有效地处理β-内酰胺环类抗生素生产废水,对处理该废水的活性污泥中的高效降解菌进行筛选、分离,并对其最佳作用条件进行了研究.结果表明,分离得到的4株菌对废水中的有机物具有高效降解作用并对β-内酰胺环类抗生素具有相当的耐受能力,在温度为35℃、摇床转速为150 r/min、初始pH值为7.0、水样中的磷含量为40 mg/L的条件下,混合菌对水样中COD的去除率可达95%.     

雌激素对双齿围沙蚕性比、生长和卵母细胞发育的影响

将性未分化的双齿围沙蚕Perinereis aibuhitensis暴露在双酚A和17β-雌二醇两种雌激素下,研究了雌激素对双齿围沙蚕雌雄比例、个体生长、死亡率及卵母细胞发育的影响。结果表明,两种雌激素各浓度下的试验组沙蚕均为雌性。与对照组相比,双酚A浓度为50、100μg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用(P<0.01);浓度为10、150μg/L时,对沙蚕的促生长作用显著(P<0.05);浓度为200μg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显;沙蚕的死亡率随双酚A浓度的提高而增加。与对照组相比,当17-β雌二醇浓度为1、5、15 mg/L时,对沙蚕有极显著的促生长作用(P<0.01);浓度为30 mg/L时,对沙蚕的促生长作用显著(P<0.05);浓度为45 mg/L时,对沙蚕的促生长作用不明显;随着浓度的提高,沙蚕的死亡率明显加大。双酚A浓度为10¹50μg/L、17β-雌二醇浓度为1150μg/L、17β-雌二醇浓度为1³0 mg/L时,对沙蚕卵母细胞的生长有明显的促进作用(P<0.01);而双酚A浓度为200μg/L(P<0.05)和17β-雌二醇浓度为45 mg/L(P<0.01)时对卵母细胞的生长有抑制作用。     

顶空-毛细管气相色谱法同时测定水中二硫化碳和卤代烃

建立了采用顶空-微池电子捕获检测器气相色谱同时测定水中二硫化碳和卤代烃的方法,并对测定条件和影响因素进行了探讨.结果表明,在该方法下二硫化碳在100～3 500μg/L,三氯甲烷在0.5～100μg/L,四氯化碳在0.5～45μg/L之间呈线性,相关系数分别为0.999 18,0.999 1和0.999 3,相对标准差为3.9%～7.5%,加标回收率为98.9%～101%.该法操作简便,测定快速,进样后各待测组分在3 min内即可全部流出.     

基于分子结构评价的Bacillus subtilis β-1,4-内切木聚糖酶胰蛋白酶抗性的理性设计

饲料用酶在饲喂过程中,不可避免地会受到消化道中蛋白酶的破坏而令其使用效率受到影响,因此,饲料酶的蛋白酶抗性是其十分重要的性质之一。基于酶反应原理与计算化学理论对Bacillus subtilis 168β-1,4-内切木聚糖酶(Xyn A)的胰蛋白酶抗性进行理性设计,最终得到三个突变体——Xyn A~(R121C)、Xyn A~(R121C/K98Q)和Xyn A~(K39I)。酶学性质分析显示Xyn A~(R121C)和Xyn A~(R121C/K98Q)与野生型(Xyn A)的最适反应温度均为60℃,Xyn A~(K39I)为40℃;突变体酶与野生型酶的最适p H都是6.0;人工肠液(p H 6.8,10 mg/ml胰蛋白酶溶液)处理野生型及其突变体后,Xyn A~(R121C/K98Q)和Xyn A~(R121C)的残留酶活力均明显比野生型高,它们的半衰期分别是野生型的2.02倍和1.52倍,Xyn A~(K39I)在胰蛋白酶溶液中的半衰期为90min,比野生型缩短了37 min。     

高效液相色谱法测定安徽产石菖蒲中α-细辛醚、β-细辛醚的含量

目的建立高效液相色谱(HPLC)法测定安徽产石菖蒲中α-细辛醚和β-细辛醚含量的方法,并对安徽产石菖蒲药材进行质量评价。方法采用VP-ODS(4.6 mm×150 mm,5μm)色谱柱,对以下色谱条件进行考察,流动相分别为甲醇-水(含0.1%甲酸)60∶40,55∶45,70∶30,温度分别为35,30,25℃,检测波长分别为257,253,250 nm,确定最佳色谱条件,并在最佳色谱条件下测定安徽产石菖蒲中α-细辛醚和β-细辛醚的含量。结果最佳色谱条件:流动相为甲醇-水(含0.1%甲酸)55∶45,流速1.0 m L/min,柱温3 0℃,检测波长250 nm。α-细辛醚平均回收率为99.17%,RSD为2.35%;β-细辛醚平均回收率为9 9.53%,RSD为2.14%。结论该方法灵敏简便、重复性良好、结果准确可靠,可用于石菖蒲的质量评价。     

L-谷氨酸氧化酶的克隆表达、纯化及酶学性质研究

为提高微生物产L-谷氨酸氧化酶水平,将Streptomyces sp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因(LGOX)与表达载体pET28a连接,导入E.coli BL21(DE3),实现LGOX的高效表达。采用HisTrapTMFF亲和层析柱对重组L-谷氨酸氧化酶进行纯化,并对纯酶的酶学性质进行了研究。结果表明:在IPTG终浓度为0.4 mmol/L下,30℃诱导6 h,可以获得比酶活为1.1 U/mg的粗酶液;重组酶的最适反应温度和pH分别为37℃和5.0;Km值为2.12 mmol/L,Vmax为1.06μmol/min.mg,对L-谷氨酸具有专一性;具有良好的应用前景。     

光催化/生物三相流化床工艺处理4-氯酚废水

对可见光催化/生物三相流化床组合工艺处理4-氯酚废水的性能进行了研究.试验结果表明:光催化可明显提高4-氯酚废水的可生化性,光催化6 h后,初始浓度为100 mg/L的4-氯酚废水的BOD5/COD达到0.35,24 h后增大到0.6;可见光催化/生物三相流化床组合工艺对中、低浓度的4-氯酚废水具有良好的处理效果,经过12 h的可见光催化和96 h的生物三相流化床降解,出水的4-氯酚和COD浓度分别为4、16 mg/L.     

重组角质细胞生长因子-1在杆状病毒表达系统中的表达及其生物活性研究

目的:利用杆状病毒载体表达系统(baculovirus expression vector system,BEVS)表达重组角质细胞生长因子-1(KGF-1),并对其进行鉴定纯化及活性测定。方法:PCR扩增角质细胞生长因子-1基因(KGF-1)序列,克隆到pFastBac杆状病毒转座载体,经酶切测序鉴定出阳性重组转座载体pFastBac-kgf1后,转化含有穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞,蓝白斑筛选出阳性质粒Bacmid-kgf1,转染Spodoptera frugiperda(sf9)昆虫细胞。对收获的蛋白进行SDS-PAGE、Westernblot鉴定。利用肝素亲和层析柱和阳离子交换柱对目的蛋白进行纯化,BaF3细胞检测细胞增殖活性,并利用C57BL/6小鼠检测促毛囊增殖活性。结果:分子量约21 kDa的KGF-1在昆虫细胞中实现了表达。病毒侵染细胞48 h时开始表达目的蛋白,到96 h时表达量达到最高;且感染复数multiplicity of infection(MOI)为4时表达量较好。经过纯化之后,蛋白纯度达到90%以上,蛋白产量达2 mg/L。纯化之后的蛋白对转染FGFR2Ⅲb的BaF3细胞在0.10 ng/ml-1.56 ng/ml之间有促增殖活性,呈剂量依赖关系。并且KGF-1处理后小鼠毛囊增殖效果有所加强。     

氯化血红素与十二烷基-β-D-麦芽糖苷复合胶团的催化氧化性能

研究烷基糖苷类非离子表面活性剂十二烷基-β-D-麦芽糖苷(n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside,DDM)与氯化血红素组成的仿生复合体系的催化氧化性能,用动态光散射和紫外可见吸收光谱法表征两者的胶团化行为以及DDM对氯化血红素的分散效果,采用过氧化氢作为氧化剂底物,考察两者所形成复合体系针对模型化合物酸性橙的催化氧化性能。结果表明:该催化反应的动力学过程服从米-曼氏方程,用Lineweaver-Burk作图法求得对底物酸性橙的米氏常数(Km)和最大反应速率(vmax)分别为0.1 mmol/L和6.0×10~(-4)mmol/(L·min);对底物过氧化氢的Km和vmax分别为4.6 mmol/L和9.2×10~(-4)mmol/(L·min);与天然过氧化物酶相比,氯化血红素-DDM复合胶团催化体系制备容易、成本低、稳定性好。