溶葡球菌酶在乳酸克鲁维酵母中重组表达、诱变、优化及酶学研究

根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(p KLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K.lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K.lactis GG799/p KLAC1-Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8 000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖和NH_4NO_3可提高酶比活性,最适表达p H为7.0~7.5,最适反应p H为7.0~8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,p H 3~6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr~(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Ba~(2+)、Ca~(2+)、Zn~(2+)、Cu~(2+)、Mn~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的抑制作用。     

地衣芽孢杆菌谷氨酰内切酶的克隆表达与性质研究

谷氨酰内切酶在食品行业应用广,但来源受限。以地衣芽孢杆菌ATCCl4580基因组DNA为模板,PCR扩增出670bp大小的谷氨酰内切酶基因,克隆入表达载体pET28a(+),转化Escherichia coli BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白主要以包涵体形式存在。通过与硫氧还蛋白融合、降低诱导温度和共表达分子伴侣三种策略,以期增加重组蛋白可溶性,结果表明分子伴侣对可溶性有明显提高作用,而低温和硫氧还蛋白影响甚微。将重组蛋白样品与底物(Z-Phe-Leu-Glu-pNA)进行孵育反应,结果表明,该酶可有效水解谷氨酸残基的羧基,释放出4-硝基苯胺。酶学性质研究表明,此酶的最适反应温度为42℃,最适作用pH为8.0,金属离子Mn2+对酶活有较好的激活作用。