酿酒酵母表面展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质研究

固定化酶是酵母表面展示技术的1个重要应用方向。本文应用食品级酵母展示表达系统进行表达,成功获得具有生物活性且固定在酿酒酵母细胞表面的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,并测定其酶学性质。结果表明,与分泌表达的自由酶相比,展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质发生了改变。其最适温度为60℃,热稳定性增强。50℃保温3 h,对酶活几乎没有影响。60℃保温1 h后的酶活为初始酶活的129.2%。随着该温度下保温时间的延长,酶活迅速下降,保温3h后的酶活为初始酶活的64.6%。70℃保温1 h,酶活增加到初始酶活的109.2%;1 h后酶活开始下降;70℃保温3 h后残留酶活仅为初始酶活的35.8%。展示表达的β-1,3-1,4-葡聚糖酶最适pH为6.0,在pH 4~7范围内酶的稳定性较好。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中.本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经Sac I线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku.β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃.     

使用分离自啤酒废水的木霉菌TP09固态发酵提纯β-葡聚糖酶

使用木霉TP09固态发酵,提纯并鉴定了β-1,3-葡聚糖酶的部分性质。采用饱和度为70%的（NH4）2SO4及DEAE-琼脂糖凝胶CL-6B柱层析纯化,β-葡聚糖酶相对粗酶溶液纯化了28.7倍,酶回收率为45.2%。经SDS-PAGE分析,该酶分子量近似54.6KD。酶最适反应pH为5.0,最适温度为50℃。在pH3.0～5.0、温度30～70℃酶活相对稳定。Fe^3＋、Mg^2＋、Mn^2＋以及Cu^2＋对该酶有抑制作用,Zn^2＋、Ca^2＋和Fe^2＋则有激活作用。底物选择性研究表明该酶为β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶。该酶可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷键的底物,对含α-1,4和α-1,6糖苷键的底物无作用。表明分离自啤酒废水的木霉TP09生产的β-1,3-葡聚糖酶可增强不溶性β-1,3-葡聚糖的可溶性,促进了其在免疫疗法中的应用。     

微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质和基因工程研究进展

对微生物β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶学性质,基因克隆和表达等方面研究进展作了综述.     

拟青霉WPG-1的鉴定及固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶条件的优化

从土壤中筛选出一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的耐热真菌WPG-1,经过鉴定为拟青霉属(Paecilomyces sp.)。通过单因素试验优化拟青霉WPG-1固体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的发酵条件。结果表明,该菌株产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最佳条件是:以燕麦粉为碳源,蛋白胨为氮源(氮素含量0.2%),初始水分含量70%,初始p H为自然,培养温度45℃为最佳产酶条件。在优化后的条件下培养5 d产β-1,3-1,4-葡聚糖酶水平高达1 324.49 U/g干基碳源。     

使用分离自啤酒废水的木霉菌TP09固态发酵提纯β-葡聚糖酶

使用木霉TP09固态发酵,提纯并鉴定了β-1,3-葡聚糖酶的部分性质。采用饱和度为70％的（NH4）2S04及DEAE--琼脂糖凝胶CL-6B柱层析纯化,β-葡聚糖酶相对粗酶溶液纯化了28．7倍,酶回收率为45．2％。经SDS--PAGE分析,该酶分子量近似54．6KD。酶最适反应pH为5．0,最适温度为50℃。在pH3．0-5．0、温度30℃-70℃之间酶活相对稳定。Fe3＋、Mg2＋、Mn2＋以及Cu2＋对该酶有抑制作用,Zn2＋、Ca2和Fe2＋则有激活作用。底物选择性研究表明该酶为β-1,3、β-1,4-葡聚糖酶。该酶可作用于含β-1,3、β-1,4糖苷键的底物,对含α-1,4和α-1,6糖苷键的底物无作用。以上表明分离自啤酒废水的木霉TP09生产的β-1,3-葡聚糖酶可增强不溶性β-1,3-葡聚糖的可溶性,促进了其在免疫疗法中的应用。     

工业酿酒酵母重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶部分酶学性质的研究

用刚果红法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力,研究重组酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株SC-βG分泌表达的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的部分酶学性质,并与出发菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达的原始酶的性质进行比较。结果表明,重组酶保持了与原始酶相同的底物专一性。重组酶的最适反应温度为35℃,而原始酶为55℃。重组酶的热稳定性也发生了改变,40℃热处理20min只保留63.4%的最初酶活力,但温度再升高时对热处理敏感度降低,70℃的热处理20min仍保留45.9%的最初酶活力;而原始酶50℃时稳定,60℃以上的热处理酶活力损失很大。与原始酶相比,重组酶的最适pH值下降为pH5.0,而原始酶为pH6.5;相比原始酶在pH7.0有最大稳定性,重组酶在pH5.5时有最大稳定性。重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适反应条件与原始酶相比更接近啤酒的实际生产条件。     

泡盛曲霉液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件优化

从土壤样品中筛选得到一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的真菌,经鉴定为泡盛曲霉(Aspergillus awamori),命名为Aspergillus awamori CAU33。依次采用单因素试验和响应面分析法优化了其液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的条件,得到该菌株产酶的最适条件为:玉米芯质量浓度55 g/L、大豆蛋白胨质量浓度25 g/L、曲拉通X-114质量浓度23 g/L、初始pH 4.5、培养温度35℃、培养时间6 d。在此条件下β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到8 447 U/m L,为优化前的17.6倍。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶研究进展

β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是一类内切型糖苷水解酶,广泛存在于各类微生物及植物中,对谷物β-1,3-1,4-葡聚糖的水解具有重要作用。在食品工业及饲料工业有着广阔的应用前景。目前已有GH16、GH17及GH26 3个糖苷水解酶家族的β-1,3-1,4-葡聚糖酶结构得到解析。本文针对β-1,3-1,4-葡聚糖酶的来源、性质、结构、功能及应用的国内外研究现状进行综述。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶在大肠杆菌中的高效分泌表达

在大肠杆菌中实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶的高效分泌表达。将实验室自主开发的信号肽ff53与β-1,3-1,4-葡聚糖酶成熟肽基因(bgl)进行融合连接到p ET-28a(+)上;通过优化诱导表达条件,28℃、8 g/L乳糖诱导10 h,重组菌E.coli BL21/p ET-ff53-bgl发酵液上清中β-1,3-1,4-葡聚糖酶活力达到1093 U/m L,与IPTG诱导的重组菌E.coli BL21/p ET-bgl(583 U/m L)相比,提高了0.87倍。本研究为高密度发酵制备该酶奠定了基础。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌诱变选育及基因克隆表达

为获得β-1,3-1,4-葡聚糖酶高产菌株,以高地芽孢杆菌YC-9为出发菌株,通过亚硝基胍(nitrosoguanidine,NTG)和低能N+束诱变育种,筛选和选育得到两株突变株N-2-2和10-30s-3,发酵培养60 h,酶活力分别达到28.6 U/m L和36.1 U/m L,分别是出发菌株的2.36倍和2.98倍,与YC-9菌株相比,突变菌株菌体生长下降但发酵产酶量增加。进一步将β-1,3-1,4-葡聚糖酶克隆并在大肠杆菌中成功表达,经过30℃诱导6 h后,胞内酶活力达79.2 U/m L,为出发菌株的6.5倍。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶研究进展

β-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）是一类内切型糖苷水解酶,广泛存在于各类微生物及植物中,对谷物β-1,3-1,4-葡聚糖的水解具有重要作用。在食品工业及饲料工业有着广阔的应用前景。目前已有GH16、GH17及GH26 3 个糖苷水解酶家族的β-1,3-1,4-葡聚糖酶结构得到解析。本文针对β-1,3-1,4-葡聚糖酶的来源、性质、结构、功能及应用的国内外研究现状进行综述。     

黄曲霉产胞外β-1 ,3-1 ,4-葡聚糖酶的发酵条件优化

研究发现一株高产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的黄曲霉菌株,优化了其产酶条件并考察了粗酶潜在的工业应用价值。依次采用单因素法和响应面分析法优化该菌发酵产酶条件,得到其优化产酶条件:麸皮19 g/L、磷酸氢二铵30g/L、吐温-60 21 g/L、NaCl 5 g/L、MgSO_4·7H_2O 0. 5 g/L、KH_2PO_40. 75 g/L、培养基初始pH值8. 0、培养温度38℃、培养时间6d。在此条件下,黄曲霉能够分泌的最高胞外β-1, 3-1,4-葡聚糖酶酶活达155.9 U/mL。水解研究发现,该酶能高效降解大麦粉和燕麦粉中的β-葡聚糖,并直接生成葡萄糖。这些结果表明,黄曲霉能高效分泌β-1,3-1,4-葡聚糖酶,且该酶具有较强的工业应用前景。     

扇贝消化腺β-1,3-葡聚糖酶的分离和性质研究

以扇贝加工废弃物消化腺为原料,经磷酸缓冲液抽提、80%饱和度硫酸铵沉淀、DE52纤维素离子交换层析和Sephadex G-100分子筛层析等步骤,获得β-1,3葡聚糖酶.经SDS-PAGE检测,扇贝消化腺β-1,3-葡聚糖酶的相对分子质量为157kDa.β-1,3-葡聚糖酶水解木耳多糖(β-1,3-葡聚糖)的最适pH为7.0,最适温度为30℃.通过Lineweaver-Burk作图,得到其米氏常数Km为13mg/mL.     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株筛选、鉴定及酶基因克隆和序列分析

目的:筛选和鉴定β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株并对酶基因进行克隆和序列分析。方法:利用透明圈法从食堂锅炉排水口污泥中分离筛选菌株,并采用形态和生理生化特征鉴定菌株。通过PCR方法扩增酶基因,将其克隆于T-载体,用Sanger双脱氧链终止法测定序列。结果:分离筛选的β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株呈长杆状、革兰氏染色可变、兼性厌氧、产芽孢(次端生、孢囊膨大)。生理生化试验结果表明:该菌株与浸麻芽孢杆菌(Bacillusmacerans)最为相近,命名为BacillusspA3。PCR扩增获得的酶基因全长734bp,其中开放阅读框架为717bp,编码238个氨基酸。经Blast分析,该序列与多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)和浸麻类芽孢杆菌(B.macer-ans)相似性较高,分别为98%和82%。结论:成功分离了β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶源菌株BacillusspA3,酶基因序列与多粘芽孢杆菌和浸麻类芽孢杆菌有较高的同源性。     

产β-葡聚糖酶高产菌株的驯化及筛选

根据刚果红与β-1,3、β-1,4-葡聚糖紧密结合而保持红色的特征,筛选β-葡聚糖酶高产菌株.本实验室保存的黑曲霉QYW-01经紫外诱变和产酶驯化,获得一株高产β-葡聚糖酶的黑曲霉QYW-01A06,在摇瓶条件下发酵液酶活力达2642U/mL,是出发菌株的2.4倍.     

工业酿酒酵母重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶部分酶学性质的研究

用刚果红法测定β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶活力,研究重组酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株SC-βG分泌表达的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的部分酶学性质,并与出发菌株枯草芽孢杆菌(B.subtilis)表达的原始酶的性质进行比较。结果表明,重组酶保持了与原始酶相同的底物专一性。 重组酶的最适反应温度为35℃,而原始酶为55℃。重组酶的热稳定性也发生了改变,40℃热处理20min只保留63.4%的最初酶活力,但温度再升高时对热处理敏感度降低,70℃的热处理20min仍保留45.9%的最初酶活力;而原始酶50℃时稳定,60℃以上的热处理酶活力损失很大。与原始酶相比,重组酶的最适pH值下降为pH5.0,而原始酶为pH6.5;相比原始酶在pH7.0有最大稳定性,重组酶在pH5.5时有最大稳定性。重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的最适反应条件与原始酶相比更接近啤酒的实际生产条件。     

超声-酶-碱法提取啤酒废酵母β-1，3-葡聚糖的研究

采用超声-酶-碱法从啤酒废酵母中提取β-1,3-葡聚糖,在超声波预处理和酶解最佳条件的同时,利用响应曲面法研究分析NaOH浓度、温度、用量和时间对β-1,3-葡聚糖得率、纯度和蛋白质含量的影响.试验结果表明,超声波处理后破壁率为94.22%;酶解后蛋白质去除率为62.82%;当加入2.05%的NaOH 30.50 mL,74℃处理5.7 h,β-1,3-葡聚糖的得率为10-21%,纯度为88.14%,蛋白质含量为1.19%.超声-酶-碱法处理工艺具有β-1,3-葡聚糖得率、纯度高、蛋白质含量低及提取时间短的特点.     

甜菜与BNYVV互作过程中PR基因的诱导表达

以抗病性不同的4个甜菜品种为材料,分别接种BNYVV,研究甜菜与BNYVV互作过程中几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性和诱导几丁质酶、β—1,3-葡聚糖酶基因表达及其与抗丛根病的关系。结果表明：BNYVV不同程度地诱导了4个甜菜品种几丁质酶、β—1,3-葡聚糖酶活性的提高,抗病品种比感病品种具有较高的几丁质酶和β—1,3-葡聚糖酶活性,并且抗病品种的酶活性高峰出现的时间早于感病品种;抗病品种的几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶基因的表达均早于感病品种,表达量大于感病品种,且持续的时间较感病品种长。BNYVV不同程度地诱导甜菜病程相关蛋白基因的表达,从而有效激活了甜菜抗病防御反应系统,提高了甜菜抗病性。     

β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在热带水果保鲜中的应用

通过对β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的抑菌性质进行分析,综述了β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在果蔬方面的抗病害研究进展,对β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶在热带水果采后保鲜中的作用进行了展望.