蓝莓果实中花色苷单体的色谱分离纯化

为充分开发蓝莓果实的潜在应用价值,主要采用柱色谱法及半制备高效液相色谱法系统研究蓝莓果实中花色苷(花青素的糖苷形式)单体的制备技术。蓝莓花色苷粗提液经超声辅助浸提、乙酸乙酯萃取2次,能够促进花色苷类物质的溶出,并有效去除溶液中的黄酮类杂质。经Amberlite XAD-7HP大孔树脂层析、Sep-Pak C18固相萃取,所得蓝莓花色苷粗品的纯度为62.49%。经Sephadex LH-20凝胶色谱柱分离,获得的3种花色苷纯化组分纯度在65%~75%之间。运用半制备型高效液相色谱技术从3种花色苷纯化组分中制备出两种蓝莓果实中含量较低的半乳糖苷化的花色苷单体,经分析型高效液相色谱鉴定为飞燕草素-3-O-半乳糖苷和锦葵色素-3-O-半乳糖苷,纯度分别为96.98%和95.63%。本研究为花色苷单体的规模化生产提供了技术参考,同时为实现蓝莓花青素高附加值产品的生产提供良好理论依据。     

大孔树脂-中压柱层析联用分离纯化蓝莓花色苷

以蓝莓果实为原料,采用大孔树脂-中压柱层析联用分离纯化蓝莓花色苷。分别比较6 种不同类型树脂 对蓝莓花色苷静态吸附-解吸效果,优化大孔树脂分离纯化蓝莓花色苷的工艺。结果表明：D101大孔树脂对蓝莓 花色苷的分离效果最佳,对花色苷的吸附属于多分子层吸附。在柱压力为1 MPa、温度25 ℃、上样液质量浓度为 0.073 mg/mL、洗脱剂乙醇体积分数为80%、流速5 mL/min条件下,经D101大孔树脂柱分离后,花色苷纯度从5.53% 增加到75.58%,提高了12.67 倍。采用Sephadex LH-20中压柱层析对蓝莓花色苷进一步分离纯化,主要得到1 种花 色苷组分,通过高效液相色谱和高效液相色谱-电喷雾质谱联用对蓝莓花色苷进行定性和定量分析,确定该组分为 矢车菊-3-O-葡萄糖苷,纯度达到90.88%。     

大孔吸附树脂分离石榴皮中安石榴苷工艺研究

采用大孔吸附树脂分离石榴皮中安石榴苷。对比吸附率和解吸率,筛选大孔吸附树脂;考察梯度洗脱和等度洗脱分离纯化效果,选择分离方式;通过单因素试验,确定分离纯化参数。试验结果显示:选用LX-3010树脂在长径比为5∶1树脂柱中以等度洗脱方式分离纯化可以得到较高的安石榴苷提取量。单因素结果显示,树脂分离条件为:吸附液浓度2.0 mg/m L,吸附时间30 min,吸附流速1.5 m L/min;洗脱乙醇浓度40%,洗脱时间180 min,洗脱流速1.5 m L/min。在此条件下,可以得到纯度为80.12%的安石榴苷纯化产物。     

甜菊糖苷的柱色谱法纯化

以甜菊糖苷的吸附量、解吸率、回收率和纯度等为指标,进行了氧化铝及多种大孔吸附树脂分离纯化甜菊糖苷的试验。静态筛选试验显示:AB-8与ADS-7二种大孔吸附树脂适用于甜菊糖苷的柱分离;动态试验显示,ADS-7比AB-8对甜菊糖苷的纯化效果更好,ADS-7的饱和吸附量为184.29 mg/g,解吸率为81.66%,回收率为74.12%,产物甜菊糖苷的纯度可达96.95%,是柱分离法制备高纯度甜菊糖甙的最佳分离树脂。     

中压液相色谱快速分离纯化Kluyveromyces fragilis β-D-半乳糖苷酶

应用AKTA explorer 100型中压液相色谱快速纯化工艺，系统分离纯化了脆壁克鲁维酵母（Kluyveromyces fragilis）β-D-半乳糖苷酶。K．fragilis发酵生产的菌体细胞经过破碎、离心后的上清液中含有K．fragilis β-D-半乳糖苷酶。粗酶经过AKTA explorer 100中压液相色谱的Hiprep^R 16／10 Source 30Q强阴离子交换柱和Hioad26／60 Superdex凝胶过滤色谱连续两步纯化，酶的回收率为27％，纯化倍数为42。纯化的K．fragilis β-D-半乳糖苷酶在垂直板十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上，呈现一条染色谱带，表明纯化的酶具有较高的纯度。K．fragilis LFS-8611 β-D-半乳糖苷酶相对分子质量约为60 000。     

酶解燕麦蛋白制备ACE抑制肽的研究

本研究以燕麦蛋白为原料,分别选用Alcalase、Neutrase 和Protamex 进行单独或联合水解,经活性炭YD-303脱色、大孔吸附树脂DA-201C Ⅱ脱盐及分级纯化、Sephadex G-25 凝胶色谱柱进一步分离,以获得高纯度、高活性的血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制肽。结果表明：单酶反应时,Alcalase 水解2h所获得的产物对ACE 的抑制率可达85.40%;YD-303 处理燕麦蛋白酶解液脱色最优工艺为添加量1.5%(W/V)、pH3.5、温度40℃、脱色时间75min。利用75% 乙醇洗脱大孔吸附树脂DA-201C Ⅱ所获得的组分ACE 抑制活性最高,其经Sephadex G-25 进一步分离纯化,得到四个分离组分,第四组分的ACE 抑制活性最高,抑制率为95.6%。     

龙葵果花色苷的分离与鉴定

采用硅胶柱层析技术分离制备龙葵果花色苷。分离得到的2 个花色苷馏分经紫外-可见光谱、高效液相色谱-电喷雾串联质谱（high performance liquid chromatography electrosprary ionization-mass spectrometry,HPLC-DADESI-MS/MS）进行结构鉴定,并结合酸水解分析糖苷种类。最终确定馏分Ⅰ为飞燕草素-3-琥珀酰阿拉伯糖苷,根据峰面积归一化法计算其纯度为94%;馏分Ⅱ为矢车菊素-3-半乳糖苷和矢车菊素-3-乙酰半乳糖苷,峰面积归一化法计算其纯度分别为45.67%和13.97%。     

金线莲苷的硅胶柱层析分离

为进一步提高金线莲苷的分离纯化效率,该研究以深度共熔溶剂提取的金线莲苷粗品为基础,比较了大孔树脂法和硅胶柱层析法分离金线莲苷的效果,并优化了硅胶柱层析法分离金线莲苷的条件。实验结果表明,DM130型大孔树脂对金线莲苷的吸附量仅为24.69 mg/g,解吸率为17.89%,且无法选择性的分离金线莲苷,而硅胶柱层析法对金线莲苷的分离效果较好;硅胶柱层析法分离金线莲苷的最佳条件为：洗脱溶剂为乙酸乙酯:乙醇:乙酸=6:4:0.2（V/V/V）,上样量为0.60 g,洗脱速率为1.25 mL/min,在此条件下,金线莲苷的回收率可达79.29%;硅胶柱层析分离组分经半制备型高效液相色谱纯化所得的金线莲苷纯度大于99.00%。该研究建立了一种简单高效的金线莲苷分离纯化流程,有利于金线莲产业的发展,为后续的研究工作提供理论支持。     

大豆异黄酮苷元的纯化

以大豆异黄酮糖苷水解产物为原料,分离纯化染料木黄酮和大豆苷元.以丙酮为溶剂进行萃取分离,通过单因素实验考察溶剂体积、萃取温度和萃取时间对分离效果的影响,最终确定分离条件为:加入30倍体积丙酮,15℃分离20 min,最终产品染料木黄酮纯度72.3%,回收率89.5%;大豆苷元纯度67.7%,回收率84%.     

α-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

利用大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,成功异源表达了一株链球菌（Streptococcus）S1的α-半乳糖苷酶基因,重组α-半乳糖苷酶经镍柱纯化后,测定其酶学性质。重组α-半乳糖苷酶最适pH值为6.5,最适温度为50 ℃,在碱性环境中（pH 7.5～10.0）及在40 ℃以下温度条件下该酶较为稳定;酶催化动力学结果显示,该酶在最适条件下水解硝基苯-α-D-半乳糖苷（pNPG）的最大水解速率（Vmax）为508.38 μmol/（min·mg）,米氏常数（Km）值为1.2 mmol/L;通过薄层层析（TLC）法检测到该重组α-半乳糖苷酶可以高效地水解天然底物蜜二糖、棉籽糖和水苏糖中的α-半乳糖苷键。     

涩柿树皮单宁的纯化及抗氧化活性

选用超声波法从涩柿树皮中提取单宁,溶剂法、大孔树脂法纯化粗提物,并考察了不同纯度的单宁对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基和羟自由基（·OH）的清除作用。结果表明：涩柿树皮单宁的超声波提取率为5.6%;大孔吸附树脂纯化涩柿树皮单宁的最佳工艺参数为：以HPD-500树脂为吸附树脂,上柱流速1.5 mL/min,上样质量浓度1.2 mg/mL;洗脱流速1.5 mL/min,乙醇体积分数60%;粗提物、乙酸乙酯萃取物、大孔树脂纯化物、乙酸乙酯萃余物经大孔树脂纯化后产物、乙酸乙酯萃取物经大孔树脂纯化后产物的纯度分别为5.6%、11.5%、19.4%、47.4%、53.3%;当质量浓度为1 mg/mL时各纯度单宁对DPPH自由基有最大清除率,清除率分别为69.07%、80.19%、92.96%、94.02%、94.05%;清除DPPH自由基的IC50值分别为0.68、0.52、0.13、0.12、0.11 mg/mL;当质量浓度为0.9 mg/mL时各纯度单宁对·OH有最大清除率,清除率分别为43.04%、73.99%、83.00%、94.68%、96.23%。     

柑橘柠檬苦素大孔树脂分离纯化方法

以柑橘柠檬苦素为考察指标,研究大孔树脂分离纯化柠檬苦素的工艺条件。结果表明,D101大孔树脂对柑橘柠檬苦素有较好的吸附分离性能,是分离纯化柑橘柠檬苦素的适宜大孔树脂;D101大孔树脂分离纯化柑橘柠檬苦素的最佳工艺条件为：上样流速1 mL/min、上样质量浓度0.5 mg/mL、用 pH 6、80%的乙醇溶液作洗脱剂、洗脱流速2 mL/min。通过树脂回收重复使用,发现D101树脂通过再生处理后,其吸附性能未有明显降低,可以重复使用。采用上述方法得到D101大孔树脂对柠檬苦素的吸附率为88.53%,解吸率为93.47%,得率为82.75%。高效液相色谱检测可知,柠檬苦素的含量达到了92.79%。     

莲子红衣多糖的分离纯化及结构表征

以莲子红衣为实验对象,将其中的多糖进行分离、纯化并表征结构。采用酶提醇析法提取莲子红衣粗多糖,选择DEAE-C阴离子交换树脂和Sephadex G-25凝胶柱层析,从莲子红衣粗多糖中分离纯化得到中性多糖和酸性多糖两种组分。经凝胶渗透色谱测定,中性和酸性多糖的重均分子质量分别为3.78×104 D和4.94×104 D,纯度分别为91.16%和90.24%。中性多糖组分由葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖4 种单糖组成;酸性多糖组分由葡萄糖、木糖、半乳糖、岩藻糖、阿拉伯糖5 种单糖组成。红外光谱证明两种多糖中均含有糖类特征吸收峰,且为α构型的吡喃型多糖。核磁共振氢谱检测又进一步证实了两种多糖均为α构型。     

脱脂羊脑蛋白水解多肽的分离纯化及抗氧化活性

为制备羊脑蛋白抗氧化肽,本实验对脱脂羊脑蛋白含量及氨基酸组成进行了分析;采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶不同酶解时间的酶解液分子质量进行了分析;采用交联葡聚糖凝胶Sephadex G-25和Sephadex G-15对羊脑酶解产物进行了逐级分离纯化,以羟自由基（·OH）和亚硝酸根离子清除能力为指标对分离组分进行抗氧活性评价,并对纯化后的组分抗氧化活性进行了测定。结果表明,脱脂羊脑粉中蛋白含量为60.55%,在测定的17 种氨基酸中,谷氨酸和天冬氨酸这两种酸性氨基酸含量最高,且含有7 种必需氨基酸;羊脑蛋白经酶解后,分子质量集中在10 kD以下;经Sephadex G-25纯化后,得到了6 个组分,其中组分F4的抗氧化活性最强,组分F4经SephadexG-15纯化后,得到3 个组分,其中组分F4-2的抗氧化活性最强,组分F4-2对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基、·OH、超氧阴离子自由基（O2－·）、亚硝酸根离子的半数抑制率IC50分别为1.64、2.47、7.98、5.14 mg/mL。     

大叶麻竹笋多糖分离纯化工艺

以水提醇沉法提取到的大叶麻竹笋粗多糖为原料,对其进行脱蛋白、透析脱色、DEAE-52纤维素柱层析分级、Sephadex-50葡聚糖凝胶柱分级处理,探究大叶麻竹笋多糖的分离纯化工艺。研究结果表明,木瓜蛋白酶结合Sevag法是最佳脱蛋白条件;进行DEAE-52纤维素柱分级,以纯水、0.05 mol/L和0.1 mol/L NaCl溶液洗脱获得了3 种主要的大叶麻竹笋多糖组分BSP1、BSP2、BSP3;再进行Sephadex-50葡聚糖凝胶分级,分别纯化得到了BSP1A、BSP2A、BSP3B 3 种多糖组分,这3 种多糖组分基本不含蛋白质和核酸,且纯度均达到了95.3%以上。     

大孔吸附树脂纯化花生根中白藜芦醇工艺及其动力 学研究

以花生根白藜芦醇提取液为原料,对选取的5种大孔树脂进行静态吸附试验,确定DA-201树脂为最优吸附树脂.通过DA-201树脂吸附白藜芦醇的动力学试验、DA-201树脂等温吸附试验、上样量试验与动态洗脱试验以及考察上样流速、洗脱流速和洗脱溶剂浓度的三元二次通用旋转组合设计柱层析试验等研究发现:DA-201树脂等温吸附白藜芦醇过程符合Langmuir和Freundilch方程.在上样质量浓度为0.7 mg/mL,上样液pH 3,上样体积为20 mL,洗脱体积为15 mL的条件下,进行DA-201大孔吸附树脂柱层析纯化试验,建立了大孔吸附树脂柱层析纯化白藜芦醇的数学模型.经回归与方差分析,对方程进行局部寻优得出:在上样流速1.00 mL/min,洗脱流速1.60 mL/min,乙醇体积分数75%,其纯化后白藜芦醇的得率为(80.13±0.01)%,经HPLC检测其纯度可以达到39.61%.     

方格星虫多糖的分离纯化及单糖组成

方格星虫多糖经碱法提取、三氯乙酸脱蛋白、DEAE-52纤维素柱层析、Sephadex G-100凝胶柱层析纯化得到精制方格星虫多糖（Sipunculus nudus polysaccharide,SNPS）。测定SNPS的理化性质和单糖组成,结果表明：SNPS为白色粉末状单一组分;经理化性质测定和紫外光谱分析,表明SNPS的多糖质量分数为99.35%,糖醛酸质量分数为22.21%,不含蛋白质和核酸,不含硫酸根;气相色谱分析结果表明方格星虫多糖SNPS主要由阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖组成,其物质的量比为1.16∶9.54∶1。本研究表明SNPS是从方格星虫中得到的均一组分纯多糖。     

石榴皮多酚分离纯化及对脂肪酸合成酶抑制作用的研究

以总多酚质量分数、吸附率、解吸率为指标,进行石榴皮总多酚的分离纯化研究,并通过反相高效液相色谱（reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC）法测定石榴皮多酚中的鞣花酸、安石榴苷、绿原酸、槲皮素和表儿茶素质量分数。同时研究石榴皮多酚纯化物对脂肪酸合成酶的抑制作用。结果表明：石榴皮多酚纯化的最佳条件为采用D101大孔树脂,石榴皮溶液进柱质量浓度为10 mg/mL,流速为2 BV/h,清洗用水5 BV,乙醇洗脱剂的体积分数为70%,用量为5.5 BV;纯化后石榴皮多酚质量分数为71.64%,较纯化前多酚质量分数49.31%有明显提高;纯化后石榴皮多酚中安石榴苷、鞣花酸、绿原酸、槲皮素和表儿茶素质量分数分别为46.91%、9.44%、0.53%、0.75%、0.32%。石榴皮多酚提取物对脂肪酸合成酶的半最大效应浓度（concentration for50% of maximal effect,EC50）为0.72 mg/mL,说明石榴皮多酚对脂肪酸合成酶具有较好的抑制作用。     

鸡血藤原花青素的纯化及活性评价

采用大孔吸附树脂对鸡血藤原花青素进行纯化,并对原花青素纯度、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性进行评价。比较3 种大孔吸附树脂对原花青素静态吸附及解吸附能力,从D101、X-5及AB-8树脂筛选出X-5型树脂用于纯化。对X-5型树脂的动态吸附及解吸附条件进行优化,获得最适条件为：上样质量浓度6.00 mg/mL,上样流速2 BV/h,上样量10 BV,洗脱流速1 BV/h,洗脱剂用量2 BV。利用不同体积分数乙醇洗脱可得到不同纯度的原花青素,其中70%乙醇纯化物原花青素纯度最高,具有最强的DPPH自由基清除活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性。相关性分析表明原花青素可能是鸡血藤抗氧化及抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性成分。     

AB-8大孔吸附树脂精制芦柑皮总黄酮及黄酮类化合物的分离

目的：研究AB-8大孔吸附树脂精制芦柑皮总黄酮的工艺条件及芦柑皮黄酮类化合物的分离纯化。方法：采用AB-8大孔吸附树脂动态法精制芦柑皮总黄酮,考察上样液总黄酮质量浓度、pH值、上样流速、洗脱液乙醇体积分数对吸附解吸性能的影响;然后将精制的芦柑皮总黄酮经硅胶柱层析、半制备高效液相等技术进行分离纯化,并根据理化性质和波谱数据鉴定化学结构。结果：AB-8大孔树脂精制芦柑皮总黄酮的最佳工艺条件为上样液总黄酮质量浓度3.03 mg/mL、上样液pH 3.0、上样流速3.0 BV/h、洗脱液乙醇体积分数为90%,最优条件下可使芦柑皮总黄酮的纯度从17.8%提高到63.1%;此外,从精制的芦柑皮黄酮中分离到8 个黄酮类化合物,分别鉴定为：橘皮素、川陈皮素、4’,5,7,8-四甲氧基黄酮、5-去甲基-橘皮素、橙黄酮、橙浸膏、柚皮苷、橙皮苷。结论：AB-8大孔树脂能很好地富集纯化芦柑皮总黄酮,该法简单、可行;从精制的芦柑皮黄酮中分离到8 个黄酮类化合物,其中,4’,5,7,8-四甲氧基黄酮、5-去甲基-橘皮素、橙浸膏、柚皮苷、橙皮苷首次从芦柑皮中分得。