西藏传统发酵牦牛酸奶中乳酒假丝酵母的分离鉴定与系统发育学分析

目的开发西藏传统发酵牦牛酸奶的微生物种质资源。方法对拉萨周边牧场的10份传统发酵牦牛酸奶样品进行乳酸菌的分离过程中得到6株酵母菌,通过常规形态特征、生化和基质解吸电离飞行时间质谱法(matrix desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS)进行鉴定,对其质谱标识峰进行蛋白质水平同源性分析,采用ITS序列对其进行基因学比对。结果经生化和质谱鉴定分离的6株酵母为乳酒假丝酵母,分离酵母和已知乳酒假丝酵母通过ITS序列在GENEBANK比结果为命名有差异为马克斯克鲁维酵母,但乳酒假丝酵母可认定为其无性型变种。蛋白质同源分析结果表明6株分离菌与已知乳酒假丝酵母在蛋白质水平有一定差异,收集到其特征性蛋白质片段的标识峰12组。结论乳酒假丝酵母的分离与研究为西藏传统发酵牦牛酸奶中酵母菌的开发提供理论支撑。     

川西北牧区传统发酵牦牛酸奶中发酵毕赤酵母菌的分离鉴定

对川西北部分牧区的10份传统发酵牦牛酸奶样品进行酵母菌的分离,通过常规形态特征和26S rRNA基因测序分析鉴定出6株发酵毕赤酵母菌(Pichia fermentans)。同源性分析显示6株分离菌与已知发酵毕赤酵母菌的同源性高达99.7%~100%。实验结果为该地区传统发酵牦牛酸奶中微生物组成多样性研究以及发酵毕赤酵母菌遗传多样性研究提供参考。      

一株马克斯克鲁维酵母菌的生长及酒精发酵特性分析

该文对一株耐高温的马克斯克鲁维酵母菌株HY32的生长及酒精发酵特性进行了研究.与耐高温酿酒活性干酵母TRADY相比,菌株HY32表现出了极好的耐热能力和较好的耐酒精能力.在37℃、42℃、45℃摇瓶培养10h后,菌株HY32的活菌数分别为2.45× 108个/mL、1.76× 108个/mL和0.92× 108个/mL.将菌株TRADY和HY32按相同的接种量转接到添加了4％vol乙醇的液体培养基中,37℃摇瓶培养6h后,菌株HY32的OD600值是菌株TRADY的1.6倍.随着温度的升高和培养基中乙醇浓度的增加,菌株HY32较TRADY的相对耐酒精能力更好.菌株HY32在高温下仍具有一定的产酒能力.采用葡萄糖酒精发酵培养基进行酒精发酵,菌株HY32在42℃和45℃时发酵72h,酒精产率分别为5.25％vol和4.02％vol.木薯酒精发酵实验结果分析表明,菌株HY32的乙酸乙酯产量是酿酒酵母TRADY的10倍左右,而正丙醇和乳酸乙酯等含量较低.     

马克斯克鲁维酵母的中试发酵研究

对马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）的细胞积累展开中试发酵,并且在其培养过程中研究菌体的生长情况以及呼吸参数和代谢产物的变化规律。结果表明,通过摇瓶和3 L发酵罐的分批培养,从6株马克斯克鲁维酵母中确定了马克斯克鲁维酵母菌株F#在生长方面更具优势。利用带有尾气分析仪的50 L发酵罐对菌株F#进行分批培养和流加培养,确定了菌株F#存在Crabtree效应。并且通过线上监测呼吸商（RQ）、发酵液pH和溶氧的变化情况,以合适的补料工艺减弱了菌株F#的Crabtree效应,培养12 h后细胞干质量达（54.37±3.3）g/L,实现了细胞的大量积累,对马克斯克鲁维酵母的工业生产具有一定指导意义。     

马克斯克鲁维酵母木薯乙醇发酵工艺研究

通过单因素试验对一株耐高温马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）HY32的木薯乙醇发酵工艺进行了研究。结果表明,HY32利用木薯发酵乙醇的最佳工艺条件为料水比1∶5（g∶mL）,发酵时间96 h,接种量11%,发酵温度40 ℃,液化时间1 h,液化温度95 ℃,液化酶添加量为20 U/g淀粉,糖化酶添加量为150 U/g淀粉,硫酸铵添加量6 g/L,初始pH=5.0。在此条件下,HY32发酵木薯酒精度可达8.90%vol,淀粉利用率与淀粉出酒率分别为87.120%和49.48%,残糖量为0.03 g/L。与未优化的初始发酵条件相比,发酵醪的酒精度提高了16.65%。     

马克斯克鲁维酵母固态发酵菊粉酶培养条件的优化

在单因素试验基础上,为进一步提高马克斯克鲁维酵母固态发酵产生的菊粉酶的活力,采用全因子试验设计和中心组合设计对影响的因素进行优化,运用响应面分析模拟得到二次多项式回归方程的预测模型,优化的培养条件为：菊芋粉3．62％,玉米浆干粉2．40％,培养温度28．13℃。模型预测的最大响应值为314．71U／gds,在优化条件下酶活为316．35U／gds,二者基本一致。     

新疆传统发酵酸奶中酵母菌的分离鉴定及系统发育分析

从新疆塔城地区哈萨克族不同牧场家庭中自然发酵牛乳采集18份样品,从中分离筛选得到47株酵母菌,并进行形态鉴定、生理生化鉴定、聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）,26S rDNA分子生物学鉴定,构建系统发育树。结果表明,47株菌中包括库德毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）18株,阿萨希丝孢酵母菌（Trichosporon asahii）10株,酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）7株,丝孢酵母（Trichosporon coremiiforme）4株,马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）4株,东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）2株,发酵毕赤酵母（Pichia fermentans）1株,近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）1株。鉴定结果对进一步认识并利用哈萨克族传统发酵酸奶中酵母菌资源具有重要意义。     

PCRDGGE技术分析混菌发酵乳中马克斯克鲁维酵母与乳酸菌的相互作用

利用变性梯度凝胶电泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE)技术,对混菌发酵及贮藏过程中马克斯克鲁维酵母与乳酸菌之间的相互作用进行分析,进而对整个过程中微生物优势菌群及其稳定性进行跟踪监测。结果表明:混菌发酵及贮藏过程中微生物组成比较稳定,优势菌为嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus,ST);发酵过程中,马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的添加对乳酸菌生长起到促进作用,尤其是对保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus,LB)效果显著,贮藏期间该作用转变为抑制;整个过程乳酸菌的存在对酵母菌的生长具有一定的抑制作用。该研究可为深入探讨乳酸菌与酵母菌共同发酵机理及新型发酵乳制品的开发提供理论基础。      

马克斯克鲁维酵母对发酵乳中糖代谢的影响

采用高效液相色谱等方法,对乳酸菌单独发酵和向其中添加马克斯克鲁维酵母这两种发酵乳中乳糖代谢主要产物及关键酶活力的变化情况进行对比分析,以确定添加酵母菌对乳糖无氧代谢产生乳酸途径的影响。结果表明：添加酵母菌后乳糖降解速率明显加快（P＜0.05）,贮藏期间马克斯克鲁维酵母可以对积累的半乳糖进行利用;发酵过程中,由于酵母菌的添加使β-半乳糖苷酶及乳酸脱氢酶活力有显著提高（P＜0.05）,糖酵解途径关键限速酶--己糖激酶和丙酮酸激酶活力增加（P＜0.05）;含有酵母菌的发酵乳pH值下降（滴定酸度上升）较乳酸菌单菌发酵快（P＜0.05）,这与添加酵母菌后发酵乳中乳酸含量显著增加（P＜0.05）有关;丙酮酸含量变化不显著（P＞0.05）。该研究揭示了马克斯克鲁维酵母的添加对乳糖酵解具有一定促进作用。     

马克斯克鲁维酵母发酵产β-葡聚糖工艺优化

以马克斯克鲁维酵母为原料,研究马克斯克鲁维酵母发酵产β-葡聚糖的工艺。通过正交试验确定马克斯克鲁维酵母发酵产β-葡聚糖的培养基最佳配比,即葡萄糖用量为3.0%,酵母膏用量为2.5%,蛋白胨用量为1.0%,吐温-80用量为0.3%。以确定的最佳培养基,通过响应面分析法确定马克斯克鲁维酵母产β-葡聚糖的最佳发酵条件,接种量为5.2%,装瓶量31.3%,p H为5.1,发酵温度为31.9℃,β-葡聚糖得率达到6.03%。     

西藏地区牦牛发酵乳制品中乳酸菌的分离与鉴定

实验分析西藏牧民家庭制作的牦牛发酵乳制品中酸奶和奶渣的微生物数量,通过菌种选择分离,采用传统分类与16S rRNA基因序列测定的方法对分离的乳酸菌进行了鉴定。结果表明:3份发酵牦牛乳样品中乳酸菌数为1.04×104～2.10×106CFU/ml,酵母菌数为8.20×103～6.70×105CFU/ml;2份奶渣样品中乳酸菌和酵母菌为0.2×10～1.0×10CFU/g;共分离15株乳酸杆菌、4株乳酸球菌和3株酵母;乳酸菌中10株为Lactobacillus paracasei、1株Lactobacillu fermentum、2株Lactobacillus reuteri、1株Lactobacillus brevis、1株Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus、2株Pediococcus acidilactici、另有2株分别为1株Pediococcu和1株Lactococcus菌株,未鉴定到种;L.paracasei为牦牛发酵乳制品中乳酸菌的优势种(占总分离株的55.6%)。     

应用Illumina Miseq测序分析川西高原传统牦牛发酵酸奶中细菌多样性

为探究传统发酵牦牛酸奶中细菌群落结构的多样性,本文采用Illumina Miseq高通量测序对川西高原不同地区的传统自然发酵牦牛酸奶样品进行细菌群落结构分析。结果表明,测序样品数8个,共获得375236条优化序列,平均每个样品46905条,共有88条不同的OTU;样品GC的α-多样性指数最佳,细菌群落多样性最高且分布均匀;巴塘县的两个样品相对其它县占仅有的OTU数最多,为31;8个样品在门水平上,细菌的优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes),占总样本数量的98.33%~99.96%;在属水平上,主要细菌属为乳杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属(Streptococcus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、巨型球菌属(Macrococcus)和魏斯氏菌属(Weissella),乳杆菌属(Lactobacillus)是所有样品的优势菌属,相对丰度占比69.31%~99.92%;根据样品的Heatmap和PCoA分析8份样品在属水平和种水平上的群落结构相似,具有细微的差异,不同地区的牦牛酸奶中的群落结构具有差异性和相似性。本研究结果为川西高原传统发酵牦牛酸奶微生物资源开发应用提供了理论依据。     

Isolation and characterization of Kluyveromyces marxianus mutants deficient in malate transport

In malic acid-grown cells of the strains ATCC 10022 and KMS3 of Kluyveromyces marxianus the transport of malic acid occurred by a malate-proton symport, which accepted l-malic, d-malic, succinic and fumaric acids, but not tartaric, malonic or maleic acids. The system was inducible and subjected to glucose repression. Mutants of the strain KMS3, unable to grow in a medium with malic acid, were isolated and checked for their capacity to utilize several carbon sources and to transport dicarboxylic acids by the malate-proton symport. Two distinct clones affected on malate transport were obtained. Both were able to grow on a medium with glycerol or ethanol but not with dl-malic, succinic, oxoglutaric and oxaloacetic acids as the sole carbon and energy sources. However, while one of the mutants (Mal7) displayed activity levels for the enzymes malate dehydrogenase, isocitrate lyase, and phosphoenolpyruvate carboxykinase similar to those of the wild strain, in the other mutant type (Mal6) the activities for the same enzymes were significantly reduced. Plasma membranes from derepressed cells of the wild strain and of the mutants Mal6 and Mal7 were isolated and the protein analysed by SDS–PAGE. The electrophoretic patterns of these preparations differed in a polypeptide with an apparent molecular mass of about 28 kDa, which was absent only in the mutant Mal7. The results indicated that Mal7 can be affected in a gene that encodes a malate carrier in K. marxianus. © 1998 John Wiley & Sons, Ltd.     

马克斯克鲁维酵母菊粉酶的分离纯化和酶学性质研究

马克斯克鲁维酵母产生的孢外菊粉酶经超滤浓缩、DEAE-Cellulose阴离子交换色谱、SephadexG-100凝胶色谱分离纯化,得到两个菊粉酶组分ExoⅠ和ExoⅡ,I/S值分别为0.0249和0.0253,均属外切菊粉酶。ExoⅠ经聚丙烯酰胺凝胶鉴定为均一组分,分子量为85kD。ExoⅠ最适pH值为4.0,最适温度为60℃,Mn2+和Mg2+对酶活力有促进作用,而Cu2+、Fe2+对酶活力有抑制作用,ExoⅠ水解菊粉溶液的产物为果糖和少量葡萄糖。     

红河传统发酵豆豉中高纤溶活性菌株的分离筛选及其纤溶酶基因分析

运用脱脂乳固体培养基及纤维蛋白固体培养基的两步分离筛选法,从云南红河传统发酵豆豉中分离筛选具有高产豆豉纤溶酶活性的菌株,同时对它们的豆豉纤溶酶基因进行克隆分析,以期为新型功能性豆豉的研发提供备选菌株及理论依据。研究结果表明,两步分离筛选法能有效地从云南红河传统发酵豆豉中筛选到高产豆豉纤溶酶的菌株Bacillus subtilis LC-2-1,对该高产菌株的豆豉纤溶酶成熟肽基因分析及预测结果表明,菌株B subtilis LC-2-1确实能分泌一种由825个碱基编码275个氨基酸残基且分子量约为27.4kDa的豆豉纤溶酶,与纳豆激酶及其他豆豉纤溶酶相比差异显著,同源性仅为85.1%。同时其豆豉纤溶酶活性分析结果则表明,菌株B subtilis LC-2-1所产纤溶酶活性较高,可达79.84 U/mL。因此,本研究结果将为新型且具有溶血栓功能发酵豆豉的研发提供备选菌株及理论依据。     

发酵肉制品中乳酸菌的分离、筛选和鉴定

对发酵肉制品中乳酸菌的分离、纯化以及鉴定技术进行了研究,结果从发酵香肠、腊肠、火腿中分离筛选得到2株德氏乳杆菌,并建立了一套发酵肉制品中乳酸菌的分离鉴定方法.     

川西高原牦牛酸奶子乳酸菌遗传多样性及系统发育研究

采用16S rDNA基因的限制性酶切片段长度多态性分析(16S rDNA-PCR-RFLP)和16S～23S rDNA基因间区(ISR)的酶切多态性分析(ISR-PCR-RFLP)技术,研究分离自川西高原牦牛酸奶子的81株乳酸菌的遗传多样性,并结合16S rDNA序列分析技术研究16S rDNA-PCR-RFLP的各类群代表菌株的系统发育关系。结果表明：供试菌株共有23种16S rDNA遗传型,供试菌株按61%相似系数可分为4个类群,按81%相似系数,可分为16个类群,结合序列分析结果,乳杆菌属(Lactobacillus)、肠球菌属(Enterococcus)细菌为主要类群;16S～23S rDNA基因的ISR扩增产物的酶切分析表明,供试菌株共有19种ISR遗传型,按60%相似系数,供试菌株可分为4个类群,按80%相似系数,供试菌株可划分为14个类群。