毕赤酵母工程菌产植酸酶补料分批发酵研究

对毕赤酵母工程菌PP-MS-NPm-4-16进行了补料分批发酵条件的研究,经摇瓶试验确定了发酵条件,即接种量为4%,生长阶段最适pH值为5.0,诱导阶段最适pH值为5.5,甲醇诱导浓度为30g/L,生长阶段添加豆油浓度为1.3%,诱导阶段豆油浓度为3%。在高密度发酵阶段,恒溶氧流加为最佳甘油补料方式,经过12h甘油补料,菌体密度OD600达145;甲醇诱导96h,酶活可达306.9kU/mL。     

表达金丝桃素合成酶的基因工程菌发酵工艺研究

采用摇瓶发酵试验,分别对影响工程菌生长和表达的条件：培养基初始pH值、诱导温度、诱导时间、诱导物浓度等进行了考察,优化了重组大肠杆菌的发酵条件,确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺,即工程菌在pH值为7．4、温度为25℃、IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖）浓度为0．8mmol／L时蛋白表达量最高。     

毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶发酵条件

在50 L发酵罐水平对影响毕赤酵母表面展示米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase,RML)发酵因素进行了研究。最适初始菌体密度(OD600)约为250,最佳诱导pH为6.0;降低诱导温度能有效提高单位甲醇转化率,诱导温度为20℃和25℃时的转化率分别是30℃的1.56倍和1.32倍。在以上最适条件下单位干菌体展示酶活及生产强度分别达275.0 U/g和462.5 U/(L.h),比优化前提高54.5%。研究发现,山梨醇和甲醇混合补料有效地提高了诱导前期(t=12h)的产酶效率,当山梨醇和甲醇混合比例为1∶4及1∶5是以甲醇为单一碳源时酶活力的1.7倍。     

木薯粉与糖蜜混合发酵柠檬酸的研究

利用木薯粉进行柠檬酸发酵,研究了发酵温度、起始糖浓度、起始pH值、摇瓶发酵的装液体积对柠檬酸发酵的影响,确定了柠檬酸批式发酵的优化条件,即:35℃的发酵温度,50ml的摇瓶发酵装液体积,5.0的发酵起始pH值,12%的起始糖浓度。在此优化条件下进行了木薯粉与糖蜜混合配比的发酵实验,最终确定了木薯粉与糖蜜混合的最佳配比为9:1。     

毕赤酵母表面展示磷脂酶D高密度发酵优化

利用基因工程手段构建获得的一株细胞表面展示表达磷脂酶D的毕赤酵母工程菌株GS115/pKFS-pld,通过摇瓶单因素筛选进行发酵条件优化,确定了最佳发酵条件为:诱导产酶阶段28℃,初始pH6.5,甲醇浓度1.5%,装液量为30 mL/250 mL,250 r/min摇床培养144 h。在此优化条件下菌体量为19.6 g/L,酶活达17.8×10-7kat/g,分别是是优化前的1.38及1.44倍。同时进行了5 L规模发酵罐分批补料培养,结果表明15 mL(/L.h)速率流加甘油补料培养基6 h后,采用溶氧恒定流加法流加甲醇,诱导132 h后,菌体量及PLD活力分别达到67.4 g/L及27.3×10-7kat/g,是摇瓶发酵水平的3.44倍及1.53倍。     

重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂发酵条件优化

在获得含高拷贝猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂基因的重组菌株GS115基础上,通过分析甘油加入量、甲醇添加量、山梨醇与甲醇添加比例、诱导初始p H、诱导时间、培养基类型对重组猕猴桃果胶甲酯酶抑制剂(kw PMEI1)表达量的影响,优化了摇瓶发酵条件。结果表明:甘油加入量3%(v/v)、甲醇添加量1%(v/v)、山梨醇溶液(100%,w/v)和甲醇(分析纯)以体积比为1∶1的比例添加、p H5.5、在BMMY培养基中诱导表达5 d为最佳条件。该重组蛋白kw PMEI1的表达量最高可达700.302 mg/L。     

基于关键因素调控发酵生产过氧化氢酶

采用正交试验策略,分析了不同关键因素对重组E.coli发酵生产过氧化氢酶(CAT)的影响,确定CAT合成的最优摇瓶发酵条件为:甘油5 g/L、酵母粉35 g/L、初始pH 7.5、诱导温度为30℃。在3 L发酵罐发酵生产CAT过程中,当转速为300 r/min时,酶活力最高为201 17.2U/mL,最适发酵产酶初始甘油质量浓度为10 g/L。以0.67 g/(L·h)的速率进行流加甘油时,最高酶活达28 243.0 U/mL。在诱导开始时一次性补入16.7 g/L甘油,当发酵至47 h时CAT酶活达到最大值为50 369.5 U/mL,为优化前酶产量的2.5倍。     

毕赤酵母工程菌发酵条件的优化

从碳源、生物素、接种比率、甲醇浓度、pH、诱导时间等方面时重组酵母摇瓶发酵务件进行了研究,初步确认了摇瓶水平发酵各因素的最优条件,发现控制适宜的甲醇浓度十分重要.同时,利用30L发酵罐对长时间甲醇诱导发酵做了研究.发现随着发酵时间的增加,分泌蛋白产量先增加然后下降,菌体生长速度放慢,但菌体湿重一直在增加.     

L-亮氨酸摇瓶补料分批发酵实验

进行了补葡萄糖、补醋酸铵和硫酸铵和全组分补料的摇瓶补料分批发酵实验。实验结果显示,以初始葡萄糖浓度为50g/L,初始醋酸铵和硫酸铵浓度分别为10g/L,于发酵过程第24h起每隔12h分4次补加全组分发酵培养基,摇瓶发酵72h产L-亮氨酸21.32g/L。     

毕赤酵母发酵生产甲醇蛋白工艺条件的优化

利用实验室选育驯化出的高产甲醇蛋白的毕赤酵母(Pichia pastorisYM-SCP02)作为甲醇蛋白生产菌种,对甲醇蛋白发酵生产过程中的关键因素进行较为全面的考察和优化,初步确定了摇瓶水平发酵各因素的最优条件为接种量8%,分段发酵温度采用0~36 h,30℃,36~64 h,28℃,初始pH值为5.0,初始甲醇添加量为1.2%,装液量为50 mL/250 mL摇瓶,转速为200 r/min。在此条件下,得到的甲醇蛋白最高产量(细胞干质量)为19.3g/L。     

重组毕赤酵母表达蛋清溶菌酶发酵条件的优化

该研究以甲醇诱导型重组毕赤酵母（Pichia pastoris） NCY-2为研究菌株,在摇瓶水平上首先考察了诱导时间、甲醇含量、诱导pH及诱导温度对蛋清溶菌酶表达的影响,然后通过正交试验设计优化出了该菌株的最佳发酵条件,并进一步研究了摇瓶发酵过程中的菌体生长和酶活力随时间的变化规律。研究结果表明,蛋清溶菌酶的最适诱导时间为96 h,甲醇含量为2%,诱导pH值为3.5,诱导温度为20 ℃;在此条件下发酵液的蛋清溶菌酶酶活力达到775 U/mL,是优化前的2.2倍。 关键词：中图分类号：Q815 文章编号：0254-5071（20１7）02-0054-04 doi：     

棘孢青霉右旋糖酐酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

以右旋糖酐酶产生菌棘孢青霉F1001基因组为模板反转录合成右旋糖酐酶的cDNA（dex）,基因全长1 866 bp,根据毕赤酵母密码子偏好性优化dex序列获得优化右旋糖酐酶基因（opt-dex）,分别构建dex-pPICZαA和opt-dex-pPICZαA重组质粒,电击转入毕赤酵母X33中构建重组子。通过蓝色右旋糖酐T-2000平板以及摇瓶发酵筛选获得产右旋糖酐酶的重组酵母菌株。重组酶的酶学性质分析显示,重组酶分子质量65?kDa、最适pH?5.0、最适温度35?℃,专一作用于α-1,6糖苷键。在摇瓶水平上对重组毕赤酵母表达条件进行优化,优化培养条件为培养温度25?℃、初始pH?5.0、每24?h甲醇添加量1%（体积分数）、每24?h山梨醇添加量5?g/L、吐温-80添加量4?g/L、摇瓶装液量50?mL/500?mL锥形瓶,优化后的重组右旋糖酐酶分泌表达酶活力提高到240.74?U/mL。重组酵母X33是一株适合外源表达棘孢青霉右旋糖酐酶基因的工程菌,该重组酶可替代棘孢青霉右旋糖酐酶直接应用于工业生产催化制备右旋糖酐。     

琼胶酶高产海洋细菌QM42的发酵条件优化

通过单因素试验和正交试验对琼胶酶高产海洋细菌QM42发酵条件进行了优化.经过发酵培养试验,确定优化培养基组成:蛋白胨浓度5.0g/L、酵母粉浓度0.50g/L、琼胶浓度3.0g/L;在培养初始pH值为7.0、装液量50mL/150mL、培养盐度50g/L,29℃条件下发酵48h,粗酶液酶活力达到627.65U/mL.     

桑黄液体发酵茶饮料工艺研究

以茶汁为培养基,菌丝多糖含量为评价指标,在单因素实验的基础上,利用响应面法优化桑黄液体发酵茶饮料工艺条件,得到桑黄液体发酵茶饮料的最佳工艺条件为：菌丝接种量为8%,茶水比4.15∶1（g∶L）、初始pH 5.8、培养温度24 ℃、摇瓶转速173 r/min。在此条件下,菌丝多糖含量可达到0.064 g/100 mL。     

产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究

考察了培养基组成及培养条件对重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)x-33(pGAPZA-gsh 1)合成谷胱甘肽(GSH)的影响。优化后的培养基组成为:甘油30g/L、蛋白胨40g/L、酵母膏9g/L、半胱氨酸0.36 g/L、KH_2PO_4 3g/L;培养条件为:自然pH、摇床转速200r/min、装液量为30mL/250mL、接种量为10%。在此优化条件下重组酵母的GSH产量是98.5mg/L,为优化前的2.33倍,生物量最大值达到19.6g/L。在5L发酵罐上进行放大实验,发酵结束后GSH产量、重组菌的生物量分别为97.9mg/L,18.7g/L与摇瓶发酵结果基本吻合。     

响应面法优化黑加仑果醋的发酵条件

采用响应面分析法(RSM)优化黑加仑果醋发酵的工艺条件。在初始酒精体积分数、pH值、装液量、摇床转速4个因素的单因素试验基础上,采用Box-Behnken试验设计,通过响应面分析,对黑加仑果醋的发酵工艺条件进行优化。结果表明：黑加仑果醋发酵的最佳工艺条件为：初始酒精体积分数5.7%、pH4.5、装液量97mL/500mL、摇床转速126r/min,在此条件下的验证实验表明,黑加仑果醋的醋酸转化率为96.78%。黑加仑发酵型果醋呈玫瑰红色,果香浓郁,酸爽柔和。     

桃儿七内生真菌产鬼臼毒素发酵条件研究

对鬼臼毒素(Podophyllotoxin)产生菌Ty的发酵培养基及发酵条件进行优化研究。结果表明。优化的半合成培养基组成为:可溶性淀粉2%,蔗糖2%.蛋白胨0.1%,酵母膏0.1%,K_2HPO_4 0.1%.NaCl 0.1%,pH 6.5,装液量80 mL/250 mL三角瓶,接种量2.5%,发酵培养6d,细胞干重为8.5g/L,鬼臼毒素产量达2.418μg/L.     

粉被虫草液体培养条件的优化

通过摇瓶液体培养正交试验获得了粉被虫草的液体培养条件,即蔗糖2.5%,马铃薯淀粉2%,黄豆0.5%,牛肉膏0.5%,酵母膏0.1%,K2HPO4 0.1%,KCl 0.02%,MgSO4•7H2O 0.05%,pH5～7,装液量(100ml/250ml摇瓶),加15颗玻璃珠作分散剂,5%接种量,旋转式摇床150r/min,28℃培养7d,达到最大菌丝干重31.86g/L,于9d获得最大胞内产物3.13g/L。同时,对摇瓶液体培养和生物反应器液体深层分批培养的动力学做了较系统的研究,无论生物反应器还是摇瓶,其培养过程中相对应的pH、残糖、氨基氮、菌丝干重、胞内产物等参数变化趋势基本一致,但生物反应器培养时间大大缩短,48h即可达到最大菌丝干重29.97g/L,54h达到4.95g/L的最高胞内产物产率。生物反应器设定培养温度28℃、装液量65%、接种量10%、0.2%的消泡剂、搅拌转速350r/min、通气量(12±3)L/min、罐压1.1MPa、初始pH6.5,培养基配方用食用蔗糖3%、蔗糖糖蜜2%、花生0.5%分别替代蔗糖、马铃薯淀粉、牛肉膏以降低成本。实验表明,粉被虫草的液体培养条件基本能达到工业发酵水平的要求。