固氮斯氏假单胞菌四碳二羧酸转运调控基因dctB的功能研究

为研究固氮斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501四碳二羧酸转运相关基因dctB的生物学功能,构建了携带功能完整的dctB基因片段的广宿主质粒pLL2922,通过三亲接合将该质粒转移至dctB突变株及野生型菌株A1501,并对其以琥珀酸、延胡索酸、苹果酸等四碳二羧酸为唯一碳源的培养基中的生长情况与固氮活性进行了测定。结果表明：dctB突变株不能利用琥珀酸和延胡索酸进行生长和固氮,但能以苹果酸为唯一碳源进行生长和固氮。携带功能完整dctB的广宿主质粒pLL2922,可以互补dctB位点的突变,并部分恢复突变株的四碳二羧酸转运和固氮能力。将该质粒转入A1501野生型菌株可以提高A1501的固氮活性,在琥珀酸,延胡索酸,苹果酸为唯一碳源的培养基上固氮活性比野生型菌株提高62．8％,33．9％,27．8％。表明dctB基因对于四碳二羧酸的转运及固氮能力均具有重要作用。     

低温冷冻对申克氏孢子丝菌的影响

申克氏孢子细菌生物学的研究,目前只有对高温的测试,认为该菌耐热性弱,然而对低温冷冻有何影响?生物学性状如何?尚未见报导,能否用现代的治疗手段——冷冻疗法治疗孢子丝菌病等是本文研究的中心。一、实验材料与方法1.使用菌株:我院真菌室保存的标准申克氏孢子丝菌,最易转换双相性的菌株。2.培养法:微量培养(钢圈法),4％葡萄糖沙氏琼脂,接种上述试验菌株,25℃培养一周,观查形成典型菌丝相,称试验标本。3.冷冻及复温条件:将上述标本若干个,每两个为一组,放入-85℃冰箱内,按原定     

esaC基因对迟缓爱德华氏菌的毒力及T3SS蛋白分泌的影响

为了确定编码迟缓爱德华氏菌(E.tarda)Ⅲ型分泌系统(T3SS)装置蛋白的esaC基因的功能,采用基因敲除的方法构建了E.tarda野生型致病菌株LSFAO的esaC基因无极性缺失突变株LSE40ΔesaC,该突变株缺失了esaC的46-1452bp。Western blotting分析表明,由于esaC的缺失,E.tarda T3SS的输送器蛋白(EseB,EseC,EseD)不能分泌到细胞外,同时细菌的自凝聚现象消失;毒力检测发现,突变株LSE40ΔesaC对蓝曼龙鱼的半数致死量比野生型菌株提高了11.5倍。结果表明,esaC基因影响T3SS输送器蛋白的分泌和E.tarda的毒力。此研究确定了esaC基因作为E.tarda T3SS装置蛋白的功能,加深了对E.tarda致病机理的了解。     

生物絮凝剂产生菌的N+注入诱变选育及其培养条件研究

为获得高絮凝活性菌株,采用低能氮离子诱变方法,对生物絮凝剂产生菌FJ-7进行诱变选育,筛选得到一株絮凝活性高、遗传稳定性良好的突变株NIM-192.发酵产絮凝剂曲线表明,其菌体生长速度稍慢于原始菌株,但絮凝活性一直高于原始菌株,絮凝率比原始菌株提高了34.26%.进一步研究表明,蔗糖、葡萄糖、半乳糖是NIM-192产生絮凝剂的适宜碳源,酵母膏:尿素为1:1的混合氮源为最佳氮源,培养基起始pH为7～9时,发酵液的絮凝效果最好.     

固氮斯氏假单胞菌固氮调节基因ntrB的功能研究

利用三亲接合的方法将含有ntrB基因部分序列的自杀载体导入固氮斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）A1501中,获得了mrB基因的非极性突变株（AdnB）。RT-PCR实验证明,AdnB菌株中与ntrB连锁的下游基因ntrC能正常转录;ntrB基因的非极性突变导致细胞完全丧失固氯能力,但其突变株能在含NH4^＋的基本培养基K中正常生长;在以硝酸盐为唯一氯源时,AdnB比野生型A1501的细胞生长延迟约14～18h,认为ntrB基因与硝酸盐的氮代谢有关。功能互补实验结果表明,AdnB的功能互补菌株能完全恢复细胞的固氮作用和对硝酸盐的利用。     

二氧化氯抑制黄曲霉菌生长和产毒能力及其在高水分玉米中的应用

该文系统研究平板条件下二氧化氯(ClO_2)对黄曲霉菌丝生长、孢子萌发,以及黄曲霉菌产毒能力的抑制作用,考察ClO_2对高水分玉米中黄曲霉菌孢子萌发的影响。结果表明:0.60 mg/L ClO_2作用40 min对黄曲霉菌丝生长抑制率为9.78%,但对黄曲霉毒素B1(AFB1)生成的抑制率达78.22%;0.75 mg/L ClO_2作用20 min即可完全抑制黄曲霉菌丝生长和AFB1产生,因此为最低有效浓度;而1.00mg/L和1.50mg/L ClO_2作用5min对黄曲霉菌孢子萌发抑制率分别达到53.38%和100%;以aw0.92的玉米为载体,9.0 mg/L的ClO_2作用60 min对黄曲霉菌孢子萌发抑菌率可达86.63%。因此,ClO_2对黄曲霉菌丝生长、产毒能力、孢子萌发都有强烈抑制作用,对抑制高水分玉米中黄曲霉菌孢子萌发也有显著效果,有潜力防控仓储前玉米中黄曲霉菌生长和AFB1污染。     

申克氏孢子丝菌的形态学及低温生物学研究

观察了在沈阳地区分离培养的申克氏孢子丝菌的超微结构和繁殖方式,并对实验菌株进行了低温生物学研究。结果发现该菌株与既往文献中报道的美国、日本及北京的同种真菌具有不同的结构和繁殖方式,即该菌株具有膨大的、呈营养型发育的假单轴状分生孢子柄,能够连续产生分生孢子,故可鉴定为申克氏孢子丝菌,而易与无此种分生孢子柄的侧孢霉属相鉴别;实验菌株具有两种繁殖方式,即全壁芽殖型发育和全壁菌体型发育;冻融对实验菌株具有损伤作用,两次冻融时细胞损伤加重,冻融后再培养生长的该菌株的芽殖现象,随冻融条件的加深而减少,细胞活性降低,从而为冷冻疗法治疗孢子丝菌病提供了初步的理论依据,并可推测反复冻融法较一次冻融法疗效更佳。     

鲜食葡萄贮运期黑斑病害致病病原菌分离鉴定

目的 通过研究鲜食葡萄黑斑病害的致病病原菌分离和鉴定,为鲜食葡萄采后病害防控措施开发提供理论支撑。方法 选用贮藏后的马奶等4个鲜食葡萄品种为研究对象,用组织分离法对引起黑斑病害的病原菌进行分离纯化,在PDA培养基上,观察拟菌株形态以及菌丝和孢子形态特征,采用有伤和无伤活体接种健康果实,并观察其发病特征,应用ITS通用引物对病原菌DNA进行扩增并测序。结果 分离出3种优势致病菌(A,B和C),检出频率分别为75.0%,32.0%和42.11%。有伤和无伤活体接种均具有致病性,且有伤大于无伤。对比《真菌鉴定手册》,初步确定拟菌株A为链格孢霉,拟菌株B为灰葡萄孢霉,拟菌株C为拟茎点霉,采用rDNA-ITS序列分析法证实拟菌株A与KJ489375.1、GU190188.1的序列相似度达到99%,结合两者结果确定主要致病病原菌为链格孢霉属小孢子种。结论 明确引起鲜食葡萄贮运期黑斑病害的主要致病菌为链格孢霉属小孢子种。     

抗稻瘟病新基因pi-hit-1的克隆与功能研究

采用差异显示法(DD-PCR)寻找易感稻瘟病的突变品系与野生型对照品系中的差异表达基因。结果发现与野生型对照相比,Rubisco小亚基、pi-hit．1(AF450251)和pi-hit-2(AF448491)基因在易感稻瘟病的突变品系中高表达,pi-hit-1和pi-hit-2是功能未知的新基因。进一步采用电子克隆和RT-PCR方法克隆了pi-hit-1基因的全长eDNA(AF514859),该基因编码的蛋白质属于ATP依赖的Clp蛋白酶家族。分析pi-hit-1基因的组织特异性表达发现,此基因在叶片组织特异表达。进一步设计接种诱导实验研究pi-hit-1基因表达与水稻稻瘟病易感性的关系。在易感稻瘟病的突变品系中pi-hit-1受稻瘟病菌诱导,接种后其表达量明显升高,而野生型对照品系pi-hit-1基因表达在接种前后无明显变化。比较易感稻瘟病的突变品系与对照品系pi-hit-1基因序列差异发现,稻瘟病敏感品系中pi-hit-1基因第一外显子发生缺失突变使pi-hit-1蛋白功能缺失,导致突变品系易感稻瘟病。这些实验结果提示野生型pi-hit-1是稻瘟病抗性基因。     

利用DNA重组技术构建产生多聚甘露糖醛酸的突变菌株

本文旨在以海洋细菌Pseudomonas sp.QDA褐藻多糖(alginate)生物合成操纵元中的algG基因为靶点,利用DNA重组技术改建褐藻多糖的生物合成途径,以期获得产生甘露糖醛酸的突变菌株.首先,利用PCR克隆algG基因两侧大小分别为1.7kb和1.8kb的DNA片段作为同源片段,用编码Gm抗性的aacC1基因替换algG基因,构建成打靶载体pEX100TUDG.将打靶载体转入QDA,利用Gm抗生素和蔗糖为选择压力进行培养,通过PCR和Southern杂交验证,获得了突变菌株.1H-NMR、PAGE和GPC分析发现,突变菌株胞外产物为多聚甘露糖醛酸.该突变菌株的获得丰富了具有较高药物开发价值的甘露糖醛酸的来源,为褐藻多糖途径工程的进一步研究提供了理论依据和技术支持.     

产脂肪酶海洋嗜冷菌的鉴定及酶学性质研究

从东海的深海底泥中筛选出一株产脂肪酶的海洋细菌 EastSeaG5-1415,该菌为革兰氏阴性好氧菌,短杆状,0.9～1.3μm×1.5～3.8μm,无鞭毛,无芽孢,无色素,菌落光滑不透明,过氧化氢酶和氧化酶阳性,甲基红实验阴性,氧化葡萄糖产酸,可耐受10%的NaCl.此菌最适生长温度为18℃,最高生长温度为35℃,在0℃也能生长,是典型的嗜冷菌.菌株脂肪酸种类为C17:1(28.2%),C18:1 9c(49.7%),辅酶Q-8是其主要的异戊烯醌类,DNA中G C含量为45.2mol%.以16SrRNA同源性为基础构建了相关种属细菌在内的系统发育树,在系统发育树中,分离菌株 EastSeaG5-1415 与 Psychrobacter glacincola 在同一分支,二者的序列相似性为97.6%,DNA 杂交显示与 P.glacincola 最为相近,达到87%.结合形态和生理生化试验,将其鉴定为嗜冷杆菌 P.glacincola.同时对其所产脂肪酶的性质进行了初步研究.该菌所产碱性脂肪酶最适反应温度为35℃,在5℃时仍有较高酶活,酶活达到23%,最适 pH 值为9,属低温碱性脂肪酶.     

产蛋白酶菌株的筛选鉴定及产酶优化

为筛选出高产蛋白酶的菌株,通过干酪素培养基筛选到一株高产蛋白酶的菌株BJ-4,经鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。对菌株的产酶条件进行单因素及响应面优化,确定最佳产酶条件为：葡萄糖0.5%、牛肉膏1.5%、培养温度37.61℃、培养初始pH值6.84、接种量1.36%,优化后酶活力同比增长了71.01%。菌株BJ-4在工业中具有一定的应用前景。     

厦门海域产蛋白酶浮游细菌的多样性研究

从厦门海域分离筛选到33株产蛋白酶浮游细菌,并通过对其16S核糖体RNA(16S rRNA)基因进行聚合酶链式反应(PCR)扩增和限制性片段长度多态性(RFLP)分析,初步研究了该海域产蛋白酶浮游细菌的多样性.研究发现,这33株菌可分为12种操作分类单元(OTU),其中OTU-Ⅰ和OTU-Ⅱ分别包含8株和12株菌株,分别占总菌数的24.2%和36.4%,为优势分离类群.分别从12种OTU中随机选取1株细菌作为代表进行16S rRNA基因测序.序列分析结果显示,属于OTU-Ⅶ的细菌为假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas sp.),而包括OTU-Ⅰ和OTU-Ⅱ在内的9种OTU 都属于弧菌属(Vibrio sp.),表明弧菌在厦门海域产蛋白酶浮游细菌中占优势.初步的生理检测显示,这些细菌的适宜生长温度为16℃左右,适宜生长盐度范围为3%～5% NaCl.     

南极产低温几丁质酶菌株的16S rDNA序列分析及其发酵条件及酶学性质研究

从南极深海沉积物中筛选到一株产低温几丁质酶的菌株AC444,经细菌形态观察及16S rDNA序列分析,该菌株属于假交替单胞菌属（pseudoalteromonas）,其最适与最高生长温度分别为15℃和30℃,属于兼性嗜冷菌。AC444菌株能利用多种碳源产酶,在含胶体几丁质和蛋白胨的培养基中产酶最高,达13．47U,最适产酶温度为20℃。酶的最适反应pH为7．0,最适作用温度为35℃,属中性低温酶。     

温州河道底质有机物降解菌株的筛选、发酵和应用研究

从温州市区的河道底泥中分离得到4株有机物降解菌株,经生长条件和形态学特性鉴定为酵母菌。确定菌株HD4最适生长条件为30℃,转速160r/min, pH值6.5,接种量为8.0%,其余三菌株在此条件下培养,生长良好。在此条件下培养的4菌株的混合菌液对河道有机物的去除率达到76.36%。     

低温纤维素酶产生菌的筛选、鉴定、生长特性及酶学性质

从北极楚科奇海分离出一株产纤维素酶的耐冷假交替单胞菌BSw20308。研究表明：该菌最适生长温度10℃,35℃不生长;在pH7．0～8．0、含2．0％～3．0％NaCl的培养基条件下最适宜菌株生长与产酶;可溶性淀粉、酵母浸出液是有利于菌株生长及产酶的碳源、氮源物质;蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖及麸皮对CMCase的合成具有明显诱导作用;CMC、麸皮、可溶性淀粉及麦芽糖对滤纸酶的合成有一定诱导作用,单糖与部分双糖(蔗糖、纤维二糖及乳糖)则起阻遏作用;在指数生长后期至稳定早期,大量产CMCase;发酵液含CMCase、滤纸酶及葡萄糖苷酶活性,以CMCase活力最高;胞外CMCase活力占总CMCase活力的74．1％左右;酶最适作用温度35℃,5℃时酶活保留50％左右;酶对热敏感,35℃半衰期为3h,25℃下酶活稳定;酶最适pH8．0。     

用核糖体工程技术二次开发海洋微生物菌株资源的研究

经对无活性的海洋来源放线菌B3054进行链霉素抗性筛选,获得了一株具有抗肿瘤活性的链霉素抗性突变株SY-1.从该突变株的发酵物中分离得到了4个活性化合物,其中1个为新天然产物.对该菌株突变前后的rpsL基因(编码核糖体蛋白S12)进行分析未发现发生突变,提示突变位点可能在核糖体的另外亚基上.实验结果表明,核糖体工程技术可用于无活性菌株资源的二次开发利用.     

D-核糖产生菌抗噬菌体菌株的选育

从D-核糖异常发酵液中分离纯化出一种噬菌体,将其命名为P001。以枯草芽孢杆菌转酮醇酶变异株为出发菌株,经紫外线诱变法选育出1株具有抗性的与出发菌株相当的突变株。对该突变株进行多次传代和D-核糖发酵试验,结果表明,该菌株对噬菌体P001抗性稳定,其发酵产D-核糖能力也没有改变。     

微生物螯合剂的合成及其条件优化研究

螯合剂被广泛应用在造纸、印染、食品等行业,化学螯合剂的不稳定性和毒性会对环境和人类产生危害,因此寻找一种绿色环保的新型螯合剂极为重要。利用微生物菌株WJ-3发酵合成铁载体螯合剂,采用单因子法,在摇床培养条件下,分别研究了不同的碳源、氮源、培养温度、摇床转速以及初始培养基的pH值,对菌株生长以及微生物螯合剂铁载体合成率的影响。研究发现:菌株WJ-3在固体和液体培养基中均能合成铁载体,在碳源为葡萄糖、氮源为酵母浸粉、温度为30℃、转速为180 r/min以及初始培养基pH值为7.0的发酵条件下,培养48 h后微生物产生的铁载体螯合剂的合成率可达64.12%;优化后的合成条件更加有利于微生物铁载体的合成。     

RP2突变体RP2-dser6的克隆和表达

视网膜色素变性是遗传性视觉损害以致失明的最常见原因之一,ＲＰ２是最近定位克隆的一个视网膜色素变性基因。为研究突变ＲＰ２蛋白与正常ＲＰ２蛋白的空间结构的差异及其对功能的影响,用突变的寡聚核苷酸引物自重组质粒ｐＥＴＲＰ２ ＰＣＲ扩增得到突变的ＲＰ２－ｄｓｅｒ６基因,克隆至ｐＥＴ１１Ｃ载体中,转化大肠杆菌ＢＬ２１菌株,重组子经序列分析鉴定后,在３７℃诱导Ｒ２－ｄｓｅｒ６突变蛋白表达,５ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰ