抗SARS-CoV鸡卵黄免疫球蛋白的制备

目的　制备抗SARS CoVIgY ,以期用于预防SARS CoV感染和阻止SARS传播。方法　用灭活的SARS CoV免疫产蛋母鸡 ,水稀释法提取IgY ,SDS PAGE检测IgY纯度 ,ELISA检测IgY抗SARS CoV的特异性和效价 ,中和试验检测中和效价。结果　灭活SARS CoV能诱导产蛋母鸡产生抗SARS CoVIgY。IgY纯度达 4 1 6 %。ELISA效价达 1∶2 0 4 8 mg蛋白 ,中和效价达 1∶5 12。结论　灭活的SARS CoV免疫产蛋母鸡能够产生高效价的特异性抗SARS CoVIgY ,并能中和SARS CoV病毒。     

IgY抗体对幽门螺旋菌菌体抗原细胞毒活性的中和作用

以超声震荡及高速离心法裂解空泡毒素基因阳性 (VacA+ )HP临床分离株 ;采用Hela细胞体外培养法分析此HP菌体蛋白的细胞毒活性及其免疫产卵母鸡制备的IgY抗体的保护作用。HP菌体抗原制备物经SDS PAGE显示至少有十余个蛋白区带 ,主要区带位于约 940 0 0和 6 70 0 0。以此HP菌体抗原包被的ELISA显示 ,球部溃疡患者血清IgG抗体滴度明显增高。体外培养中HP菌体蛋白制备物对Hela细胞具有明显的细胞毒活性 ,LD50 小于 12 μg/ml。以此抗原免疫产卵母鸡 ,提取的IgY抗体浓度依赖地阻断HP菌体蛋白的Hela细胞毒活性 ;提示局部应用抗体制剂做被动免疫 ,有可能成为治疗HP感染性疾病的有效方法     

抗咽喉炎常见菌IgY抗体的制备及其特性的研究

目的制备抗β-溶血性链球菌、G簇溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌3种咽喉炎常见菌IgY抗体,并分析其特性。方法采用超声波破碎法将3种咽喉菌制备成可溶性抗原液,免疫产蛋母鸡,从鸡蛋黄中提取IgY抗体,应用免疫电泳、ELISA、SDS-PAGE检测抗3种咽喉菌IgY抗体的特性及热稳定性。结果抗原免疫母鸡10d后,鸡蛋黄中即有抗3种咽喉菌的IgY抗体产生,60d时抗体滴度高达1∶102400,IgY抗体滴度在室温可保持5~6个月不变。结论制备的抗3种咽喉菌IgY抗体滴度高,特异性强,稳定性好。     

幽门螺杆菌重组VacA蛋黄抗体的制备

目的研制高效价、高特异性的抗细胞空泡毒素VacA的鸡蛋黄抗体(IgY),为研制幽门螺杆菌(H.pylori)治疗性抗体奠定基础。方法用纯化的重组细胞空泡毒素抗原免疫22周龄洛曼产蛋母鸡,取免后所产鸡蛋,将蛋黄稀释、离心,收集上清,加硫酸铵沉淀。以ELISA间接法检测抗体效价,Bradford法检测蛋白含量,SDS-PAGE法检测相对分子质量及纯度。结果母鸡初次免疫后76d,抗体效价达到1∶6400,最高可达1∶12800。蛋黄抗体经纯化浓缩后,用SDS-PAGE分析,出现2条蛋白带,纯度可达80%以上,其含量为25·66mg/ml。结论已成功制备了抗重组细胞空泡毒素的特异性蛋黄抗体。     

抗甲型肝炎病毒卵黄免疫球蛋白的制备及应用

目的制备抗甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,IgY),并建立双抗体夹心ELISA法,用于测定甲肝疫苗中的HAV抗原含量。方法用纯化的HAV免疫健康产蛋母鸡,制备抗HAV IgY,采用多步骤分离纯化IgY,紫外分光光度法测定纯化IgY的蛋白含量,还原型SDS-PAGE分析IgY的相对分子质量及纯度,间接ELISA法检测IgY的效价、特异性及其热稳定性和酸碱稳定性。以纯化的IgY作为包被抗体,HRP标记的抗HAV单克隆抗体作为二抗,建立双抗体夹心ELISA法,对疫苗生产过程中的HAV抗原含量进行测定,并与市售ELISA试剂盒的检测结果进行比较。结果亲和层析纯化后的抗HAV IgY浓度为3.67 mg/ml;重链和轻链的相对分子质量分别为66 000和27 000,纯度为96.78%;效价最高为1∶16 000;纯化的抗HAV IgY只与HAV呈阳性反应,与脊髓灰质炎病毒和肠道病毒71(enterovirus 71,EV71)均不反应;纯化的抗HAV IgY在25⁷0℃条件下处理15 min及经pH 3.070℃条件下处理15 min及经pH 3.0¹0.0的Tris-HCL缓冲液处理2 h,其抗体效价基本无影响。建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.6210.0的Tris-HCL缓冲液处理2 h,其抗体效价基本无影响。建立的双抗体夹心ELISA法HAV浓度在15.62² 000.00 ng/ml范围内,HAV浓度的对数值与A450值之间呈线性相关,R2=0.935,最低检测量为7.81 ng/ml,与市售试剂盒检测结果具有良好的相关性,相关系数为0.952 7。结论制备的抗HAV IgY浓度、纯度、效价均较高,特异性较强,稳定性良好,建立的双抗体夹心ELISA法可用于检测甲肝疫苗生产过程中HAV的抗原含量。     

施氏假单胞菌胞内NapA/NapB蛋白的多克隆抗体制备及蛋白免疫印迹分析

旨在探究利用蛋白免疫印迹手段测定施氏假单胞菌胞内关键酶NapA和NapB表达量的可行性。选取多肽片段合成免疫抗原,并用其免疫兔子获得相应的多克隆抗体。ELISA检测第三次免疫后两周的兔抗血清的效价,并将最终免疫产生的抗体用于施氏假单胞菌样品的蛋白免疫印迹分析。制备的多肽抗原具有良好的免疫原性,NapB免疫原效果甚佳,血清效价大于1∶160000,NapA的效价也可达到1∶14000。免疫印迹试验结果的发光图像中内参条带清晰整齐,在目标蛋白条带区域也可以看到明显反应带。本研究制备出的抗体可用于施氏假单胞菌胞内NapA和NapB蛋白的免疫印迹分析,后续还可以改变实验条件通过内参蛋白进行半定量。     

人血清载脂蛋白A-Ⅰ的分离纯化及其单克隆抗体的研制

应用密度梯度超离心结合离子交换层析分离提纯人血清载脂蛋白A－1（ApoA-I），经免疫扩散，SDS－PAGE和紫外扫描鉴定，证实其达到电泳纯．以此免疫BALB/c小鼠，应用杂交瘤技术建立了7株分泌抗人ApoA-I的杂交瘤细胞株，并对其免疫学性质进行了研究。上清效价为10－2～10－4，腹水效价为10－6～10－8．除1种MCAb为lgG2a外．其余均为IgG1。经ELISA间接法检测，证明7种McAb均只与ApoA-I发生强阳性反应．而不与人ApoA-Ⅱ、ApoB100、白蛋白、球蛋白、转铁蛋白和纤雏连接蛋白等血浆蛋白反应．免疫印迹试验证实，7种McAb在包含载脂蛋白在内的众多血浆蛋白成分中，仅持异地识别MW为28KD的ApoA-I。另外还对其中3种MCAb的相对亲和力及抗原结合位点进行了研究。     

破伤风毒素C片段的基因克隆、重组表达及免疫原性

应用PCR技术直接从破伤风芽孢杆菌质粒DNA中扩增出 1 4Kd的破伤风毒素C片段基因 ,经DNA序列测定证明其为破伤风片段C基因。将此基因克隆入大肠杆菌谷胱甘肽 S 巯基转移酶融合表达载体pGEX 4T 2 ,构建成重组表达质粒pGEX TC。经SDS PAGE蛋白电泳鉴定 ,表达产物为 76Kd的特异性重组蛋白。免疫印迹实验证实 ,重组蛋白抗原是破伤风C片段抗原。动物实验证明此重组抗原具有良好的免疫原性 ,1μg免疫剂量可使动物产生 1～ 2IU/ml的破伤风抗毒素 ,ELISA抗体滴度可达 1∶80 0。     

幽门螺杆菌尿素酶的纯化和鉴定

幽门螺杆菌超声波上清经DEAE SepheroseFastFlow和PhenylSepheroseCL 4B两步柱层析得到纯化的Hp尿素酶 ,免疫印迹显示有良好的抗原性。在pH8.0和 45℃条件下酶比活约为 2 6 5U mg ,SDS PAGE显示有 6 0 0 0 0和 30 0 0 0两个亚单位。经两步柱层析纯化后 ,Hp尿素酶回收率为 30 % ,纯化倍数达 11倍。连续纯化 3批显示工艺稳定 ,为Hp尿素酶基础研究和应用奠定基础。     

IgY的冻融法脱脂条件研究

目的寻求IgY的最佳脱脂条件。方法用人IgG免疫产蛋母鸡,待蛋黄中抗体效价达1∶64以上时,选用不同的稀释度、酸碱度、冻融次数、离心力等条件分离IgY。测定除脂率、效价、蛋白含量,以确定最佳脱脂条件。结果稀释度为1∶7,pH为5·2,冻融1~2次,离心力大于或等于3000g,离心20min以上,其除脂率可超过98%,IgY的特异性抗体效价未降低,蛋白含量平均为8·033mg/ml。结论用冻融法分离IgY能有效去除蛋黄液中的脂肪,此工艺便于批量生产低脂IgY产品。     

防龋卵黄抗体的研制

应用本室构建的龋齿疫苗工程菌株及 GTF抗原免疫母鸡 ,取鸡卵黄以水 -硫酸铵 -离子交换层析法提取纯化蛋黄抗体 (Ig Y ) ,以放免法测定血清及蛋黄中的抗体。结果用上述 2种抗原免疫的鸡 ,在血清及蛋黄中均能检出抗 GTF抗体。提纯的蛋黄抗体 ,经 SDS- PAGE电泳检测 ,相对分子质量约为 2 2 0 0 0 0 ,纯度达到 97.9% ,经 2 -巯基乙醇处理后 ,分为重链和轻链 ,相对分子质量分别约为 76 0 0 0和 2 80 0 0。经免疫印迹分析 ,具有良好的免疫学特异性。     

人乳头瘤病毒(HPV)18型晚期蛋白L1 DNA疫苗的免疫原性及安全性

目的对HPV18型DNA疫苗的免疫原性和安全性进行初步评价。方法将HPV18L1基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建DNA疫苗质粒pcDNAL1。使用脂质体将重组质粒转染COS7细胞,用Westernblot检测体外瞬时表达的抗原。将重组质粒pcDNAL1肌肉注射BALBc小鼠(100μg只),加强免疫3次后分别采集血清,用ELISA法和Westernblot法检测抗体,实时荧光定量PCR法检测质粒的组织分布。采用ELISA法检测DNA疫苗免疫后抗核抗体和抗双链DNA抗体的效价。结果重组质粒可在真核细胞中有效地转录和表达HPV18L1蛋白。小鼠免疫后可检出较高滴度的抗HPV18L1抗体和特异条带。免疫后质粒主要分布在注射部位,且随着时间延长被清除;未检测到抗核抗体和抗双链DNA抗体。结论HPV18L1重组质粒可诱导小鼠产生特异的体液免疫反应,且该DNA疫苗是安全的,为进一步研制开发HPVDNA疫苗打下了基础。     

重组人Tau蛋白的表达、纯化及鉴定

目的 重组人Tau蛋白的诱导表达和纯化。方法 将携带 Tau蛋白基因的工程菌株经IPTG诱导表达后,通过超声破碎、硫酸按盐析、离子交换层析、电洗脱等方法纯化Tau蛋白,以SDS-PAGE、非变性PAGE、Westem blot和N末端氨基酸测定等方法进行鉴定。结果 纯化Tau蛋白的得率为28.5％,在SDS-PAGE和非变性PAGE上呈均一的蛋白条带,其相对分子质量约为59000,N末端5个氨基酸测定结果为NH2-Met-Ala-Glu-Pro-Arg-。结论 本实验采用纯化重组人Tau蛋白方法是可行的。     

抗轮状病毒IgY的研制

目的用鸡卵黄制备抗轮状病毒（ＲＶ）免疫球蛋白,预防和治疗婴幼儿ＲＶ感染。方法制备ＲＶ 抗原,通过不同途径免疫母鸡,几种纯化方法联合应用从鸡卵中提取特异性鸡卵黄抗体（ＩｇＹ）,进行理化学检定及动 物效力实验。结果免疫母鸡均可产生特异性ＩｇＹ,纯度可达９１％以上,产量为４４ｍｇ／蛋;可保护乳鼠兔受ＲＶ攻击; ＩｇＹ耐热、耐酸,室温保存半年、４℃两年效价不变。结论已成功地应用ＲＶ免疫母鸡制备出高效价特异性抗ＲＶ－ＩｇＹ。     

鸡卵黄抗体(IgY)的诱导

目的　获得鸡卵黄抗体（Ｉｇｙ）,并研究该抗体在鸡的黄液中表达的进程。方法　用吗啡—牛血清蛋白 结合物为模型抗原对３０周龄产蛋鸡进行免疫诱导,用ＥＬＩＳＡ间接法测定不同时间的抗体滴度。结果全程免疫过 程中白蛋白抗体最高滴度为１：１２８００,吗啡抗体最高滴度为 １：１６００,经 ５次免疫后（４２周龄）抗体滴度不再升高。结论　为使目的抗体在鸡卵黄液中持续而高质量诱导奠定基础。     

幽门螺杆菌多亚单位融合蛋白疫苗的构建及免疫特性

目的构建幽门螺杆菌HspA、HpaA、UreB多亚单位融合蛋白疫苗,并检测其免疫原性及免疫保护性。方法用PCR从Hp基因组中分别扩增HspA、HpaA、UreB3个基因片段,重叠延伸PCR将其构建成融合基因hhu,并克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,经酶切、测序验证后,转化E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,AKATA纯化仪纯化。纯化后蛋白口服免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠特异性抗体,末次免疫后进行攻毒试验,检测其免疫保护性。结果酶切及测序证实已成功构建HspA、HpaA、UreB融合基因的表达载体phhu,SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的表达,表达率为26·8%,纯化的融合蛋白纯度大于90%,口服免疫小鼠可产生特异性抗体,保护率达89·6%。结论所获得的融合蛋白保持了亚组分蛋白各自的免疫原性和免疫保护性,为幽门螺杆菌多亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。     

抗肠道病毒71型单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(EV71)单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法将RD细胞和Vero细胞培养的EV71原液通过氯化铯超速离心纯化,分别作为免疫抗原和检测抗原,制备单克隆抗体。通过Westernblot分析、间接免疫荧光试验和ELISA法鉴定单抗的特异性。采用间接ELISA法测定单抗的酶标效价,微量细胞培养中和试验测定单抗的中和效价。结果获得1株可稳定分泌抗EV71单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单抗可与EV71特异性结合,酶标效价为1∶204800,中和效价为1∶28。结论已成功筛选出1株分泌抗EV71的单抗细胞株,为建立EV71疫苗抗原含量测定方法奠定了基础。