乙型肝炎病毒核心蛋白在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

目的探讨在枯草芽孢杆菌中分泌表达乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)核心蛋白(HBV core protein,HBc)的可行性。方法 PCR扩增HBc基因片段,插入pBE S-DNA穿梭质粒的MCS区域,构建重组质粒pBE S-DNA/HBc,将其线性化后与分泌信号肽DNA(SP DNA)连接产物转化大肠埃希菌Stellar感受态细胞,收获全部阳性菌落,并将提取的混合质粒转化至枯草芽孢杆菌RIK1285感受态细胞,ELISA法筛选分泌表达HBc蛋白的阳性菌落,选取分泌表达量最高的菌株放大培养,培养上清经亲和层析柱纯化后,SDS-PAGE及Western blot分析重组蛋白HBc的分泌表达。结果经双酶切和测序鉴定,重组质粒pBE S-DNA/HBc构建正确。随机挑选的50株重组枯草芽孢杆菌经鉴定有16株含HBc基因,其中4株培养上清中检测到重组蛋白HBc的阳性表达。经SDS-PAGE分析,重组蛋白HBc在培养上清中呈单体、二聚体及多聚体状态;经Western blot分析,重组蛋白HBc能与HBc抗体特异性结合。结论重组蛋白HBc在枯草芽孢杆菌中可实现分泌表达,...     

蔗糖异构酶Pal Ⅰ在枯草芽孢杆菌中的异源表达及应用

目的 构建表达蔗糖异构酶Pal Ⅰ的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800重组表达菌,并对其催化蔗糖转化的产物进行分析.方法 采用RF-clone方法扩增蔗糖异构酶PalⅠ基因(NCBI∶AY040843.1),克隆至pHT43载体,构建重组质粒pHT43-PalⅠ,转化至枯草芽孢杆菌B.subtilis WB8...     

肌酐酶在枯草芽孢杆菌中的异源表达及分泌机制

肌酐酶是用于临床检测肾小球滤过功能的关键酶之一,但目前国内肌酐酶的生产量较低无法满足市场需求,多依赖于国外进口。为了解决这一问题,本研究将恶臭假单胞杆菌肌酐酶基因克隆至原核表达载体pMA5实现肌酐酶在枯草芽孢杆菌1A751中的异源表达。随后通过启动子优化,使肌酐酶的蛋白表达量显著提高到1.08mg/mL,并且胞外肌酐酶的比酶活力达到238U/mg。同时发现肌酐酶可不依赖于信号肽即可实现胞外分泌,因此对肌酐酶在枯草芽孢杆菌中的分泌机制进行研究。通过对经典分泌途径和Holin途径的分析排除、利用Calcein-AM/PI双染色法鉴定表达菌株1AGC的细胞膜不完整,最后通过电子显微镜观察结果表明表达菌株表面存在潜在的泄漏位点,因此证实肌酐酶在枯草芽孢杆菌中通过细胞泄漏的方式,释放到胞外培养基中。本文构建了一株基于细胞泄漏的肌酐酶高产菌株,为肌酐酶的表达和潜在工业化应用提供理论基础,同时也为枯草芽孢杆菌泄漏表达系统提供了一定的研究基础。     

枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因的克隆与表达

目的克隆、表达枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因,并检测其酶学性质。方法从枯草芽孢杆菌染色DNA中,PCR扩增枯草芽孢杆菌耐热丝氨酸蛋白酶基因Sapr,插入载体pET-28a(+)中,构建重组分泌型表达质粒pET-28a-Sapr,热激转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),25及37℃条件下,IPTG诱导重组蛋白表达,表达的重组蛋白经10%SDS-PAGE分析,并采用Folin法测定酶活性。结果重组表达质粒经双酶切及PCR鉴定,证明构建正确,测序结果表明与GenBank中登录的序列同源性达100%;表达的重组蛋白相对分子质量约39 600,最佳诱导温度为25℃,主要以可溶性形式表达,表达量约占菌体总蛋白的12%;重组菌发酵产物酶活性为322 U/ml。结论在大肠埃希菌中成功表达的特异蛋白具有生物学活性,为进一步研究改性分离蛋白的功能特性奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌脂肪酶表达质粒的构建及其表达

以枯草芽孢杆菌168(B.subtilis 168)染色体为模板PCR扩增出P43启动子,与大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pUBC19相连得到表达载体pUBC-P43,然后将枯草芽孢杆菌脂肪酶基因lipA克隆到载体pUBC-P43启动子下游,得到重组质粒pUBCPL并转化B.subtilis TZ10.经中性红油脂平板、酶切和PCR方法鉴定得到重组菌TZ10/pUBCPL.宿主菌TZ10是B.subtilis DB104染色体缺失了lipA基因后获得.重组菌经初步发酵,以橄榄油为底物测定发酵上清液最高脂肪酶活力为49.1 U·L-1,而相应菌株DB104发酵最高酶活力仅为11.4 U·L-1.     

枯草芽孢杆菌细胞壁的研究进展

本文综述了近几年的枯草芽孢杆菌细胞壁的研究进展情况,分别从方法和结构两方面详细地总结了细胞壁的研究进展程度和应用价值,为以后的实验研究提供了理论基础。     

枯草芽孢杆菌产芽孢发酵培养基的优化研究

在三角瓶培养条件下,采用单因素实验对枯草芽孢杆菌B53发酵培养基碳源、氮源进行了优化。在此基础上进行了正交实验,确定了菌株B53最佳的产孢发酵培养基为葡萄糖25g/L、大豆蛋白胨14g/L、玉米浆17g/L、NaCl 3g/L,MgSO_4 0.2g/L。在最优条件下发酵培养,芽孢浓度为9.6×10~9个/mL。     

氨基甲酸乙酯水解酶在枯草芽孢杆菌中的表达及发酵优化

将来源于赖氨酸芽孢杆菌SC02的氨基甲酸乙酯水解酶(UH)基因在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600中进行克隆和表达,在枯草芽孢杆菌中实现了UH活性表达,在摇瓶水平通过单因素考察和响应面分析实验对氨基甲酸乙酯水解酶发酵进行优化. 结表明,酶活最高可达到14.20 U/mL,产酶最佳培养基成分为：淀粉10 g/L、磷酸氢二钾9 g/L、麦芽浸膏25 g/L、硫酸镁1 g/L、胰蛋白胨55 g/L,最适发酵温度为37℃,最佳接种量4%. 在3 L发酵罐中采用最优发酵条件,酶活在16 h达到18.03 U/mL.     

乙醇生产副产物在枯草芽孢杆菌培养中的应用

枯草芽孢杆菌是一种环境友好、生物友好的微生物,可产生抗逆内生孢子,生命力强,在自然界广泛存在。其在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶的生产中有较广泛应用,也被用作农用生防菌、微生物饲料添加剂等,同时也是替抗饲料产品的主要生产菌。DDS是废醪液经离心、MVR浓缩等工艺得到的浆液,干基蛋白质量分数在20%以上,同时富含丰富的B族维生素。由其制成的DDGS饲料中,DDS占比例越高营养价值越高。本试验使用0.2%的碱液对DDS进行简单处理后,按照10%的比例,控制培养转速110r·min^-1、温度33±0.5℃,实现了其在枯草芽孢杆菌培养中的应用,在降低枯草芽孢杆菌菌液生产成本的同时,也为DDS浆的处理提供了一种思路。     

绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　构建绿色荧光蛋白融合表达HBsAg基因的载体 ,并检测其在COS 7细胞中的表达。方法　采用PCR获得HBsAg基因 ;利用该基因片段和质粒pEGFP 3.1的HindⅢ /KpnⅠ限制性酶切位点构建融合表达载体pGHBs 3.1;通过脂质体介导的方法将该载体转染到COS 7细胞中 ,用PCR法检测基因转染 ,ELISA检测HBsAg的瞬时表达 ,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白表达。结果　融合表达载体pGHBs 3.1转染COS 7细胞后 ,在细胞中检测到HBsAg基因片段 ,转染细胞培养上清中检测到HBsAg表达 ,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论　表达载体pGHBs 3.1在COS 7细胞中获得了表达 ,表达的融合蛋白具有HBsAg和绿色荧光蛋白的双重活性 ,该载体可用绿色荧光蛋白作为报告基因观察HBsAg的表达及定位。     

绿色荧光蛋白和白介素-2在卡介菌中的共表达

目的 构建能复合表达绿色荧光蛋白和白介素－２重组卡介菌（ｒＢＣＧ０ＧＦＰ－ＩＬ－２）。方法 采用基因 工程技术构建ｐＤｍＧＦＰ－ＩＬ－２重组穿梭质粒,用电穿孔法将重组质粒ｐＤＭＧＦＰ－ＩＬ－２转化大肠杆菌和卡介菌中,采用限制酶 切,荧光显微锐下观察及ＰＣＲ方法鉴定 ｐＤｍＧＦＰ－ＩＬ－２和 ｒＢＣＧ－ＧＦＰ－ＩＬ－２。结果 琼脂糖凝胶电泳结果显示 ｐＤｍＧＦＰ－１１．２质 粒的限制酶切条带,ＰＣＲ法检测重组ＢＣＧ菌株可见明显ＩＬ－２片段扩增条带约０．３ｋｂ,ｒＢＣＧ－ＧＦＰ－ＩＬ－２液体培养菌液在长 波紫外线的照射下,发出明亮的绿色荧光,小鼠皮下接种ｒＢＣＧ－ＧＦＰ－ＩＬ－２．１周后,取组织冰冻切片在荧光显微镜下可见 绿色荧光。结论 成功构建了重组质粒ｐＤｍＧＦＰ－ＩＬ－２和共表达绿色荧光蛋白和白介素－２重组ＢＣＧ（ｒＢＣＧ－ＧＦＰ－ＩＬ－２）。     

口蹄疫病毒2B基因绿色荧光蛋白融合表达质粒的构建及表达

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)2B基因绿色荧光蛋白(GFP)融合表达质粒,并在BHK-21细胞中表达。方法RT-PCR扩增O型口蹄疫病毒WFL株的2B基因,克隆入表达载体pEGFP-C1,并进行双酶切、PCR及测序鉴定。将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,检测绿色荧光蛋白的表达和2B基因转录水平。结果经双酶切及PCR鉴定,目的基因片段大小与预期相符,测序结果与WFL株相应序列一致。荧光显微镜和流式细胞仪均检测到细胞内绿色荧光蛋白的表达,荧光定量PCR检测到细胞内有2B基因的转录。结论已成功构建了FMDV2B基因GFP融合表达质粒,并在BHK-21细胞中获得了表达。     

绿色荧光蛋白兔多克隆抗体的制备

目的制备绿色荧光蛋白(GFP)兔多克隆抗体。方法选取GFP免疫原性较强、保守性低的98～117位氨基酸序列,利用F-moc法固相合成该段序列,经高效液相色谱纯化,MALDI-TOF-MS鉴定合成多肽的分子量后,与匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰雄兔,制备抗血清,并进行Western blot鉴定。结果合成的GFP多肽经MALDI-TOF-MS分析,分子量为2497.9,与理论值相符。1∶200稀释的抗血清与转染pEGFP-N1质粒的HeLa细胞表达的增强型GFP在相对分子质量27000处有清晰的杂交信号出现。结论已成功制备了特异性较好的GFP兔多克隆抗体。     

双启动子对增强型绿色荧光蛋白表达的影响

目的研究双启动子对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的影响及双启动子的启动效率。方法分别将H1、U2、U3和U6启动子克隆至pEGFP-N1载体中的MCS位点处,构建CMV与以上各个启动子的双启动子表达载体。将重组载体转染293T细胞,荧光显微镜观察,流式细胞术检测转染效率及EGFP基因的表达效率(以荧光指数表示)。结果双启动子重组表达载体经PCR和酶切证明构建正确。流式细胞术检测表明,pEGFP-N1载体与分别插入H1、U2、U3和U6启动子的双启动子重组表达载体的转染效率分别为26.57%±1.54%、28.57%±0.99%、16.14%±1.69%、22.63%±1.77%和17.89%±1.84%;EGFP基因的表达效率分别为142.79±31.26、103.59±25.90、19.67±0.52、58.16±14.58和15.40±1.92。结论CMV与H1启动子联合驱动EGFP的表达效果与CMV单独驱动相近,而CMV分别与U2、U3和U6启动子联合驱动EGFP的表达效果显著低于CMV单独驱动。     

Expanding the Functionality of an Autoinduction Device for Repression of Gene Expression in Bacillus subtilis

Autonomous control of gene expression through engineered quorum-sensing processes is broadly applicable to biosynthetic pathways, including simultaneous control of different genes. It is also a powerful tool for balancing growth and production. We had previously engineered a modular autoinduction device for the control of gene expression in B. subtilis. Now, we expand its functionality to repress gene expression autonomously. The engineered R8 promoter responds to AHL accumulation in the culture medium. In a riboflavin-producing strain, the AHL-Lux complex exerts 5-fold repression on the R8-driven expression of the flavokinase/FAD synthetase gene ribC, resulting in a higher titer of the vitamin. We engineered a strain able to autonomously induce and repress different genes simultaneously, demonstrating the potential of the device for use in metabolic engineering.     

用于枯草芽孢杆菌的反选改造方法

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是微生物发酵中应用最广泛的一种微生物,其在酶类生产中的应用已经实现工业化,具有重要的工业应用价值。本文简要介绍了三种构建转化质粒反选盒子的方法,其不仅具有简单高效,能够进行连续的基因插入操作,同时还具有定点突变、大片段删除以研究未知基因的功能等特点,因此具有很广泛的研究和应用前景。     

Predicting the Structure and Dynamics of Membrane Protein GerAB from Bacillus subtilis

Bacillus subtilis forms dormant spores upon nutrient depletion. Germinant receptors (GRs) in spore’s inner membrane respond to ligands such as L-alanine, and trigger spore germination. In B. subtilis spores, GerA is the major GR, and has three subunits, GerAA, GerAB, and GerAC. L-Alanine activation of GerA requires all three subunits, but which binds L-alanine is unknown. To date, how GRs trigger germination is unknown, in particular due to lack of detailed structural information about B subunits. Using homology modelling with molecular dynamics (MD) simulations, we present structural predictions for the integral membrane protein GerAB. These predictions indicate that GerAB is an α-helical transmembrane protein containing a water channel. The MD simulations with free L-alanine show that alanine binds transiently to specific sites on GerAB. These results provide a starting point for unraveling the mechanism of L-alanine mediated signaling by GerAB, which may facilitate early events in spore germination.     

氯灭活水中枯草芽孢杆菌的效果

以枯草芽孢杆菌(ATCC6633)作为难灭活微生物的代表,研究了氯对水体中芽孢的灭活效果,考察了氯浓度、作用时间、反应体系pH值、温度以及芽孢初始浓度等因素的影响。结果表明,氯对芽孢的灭活过程可分为延滞期和灭活期;初始氯浓度在2.06~10.30 mg·L^-1,反应时间0~166 min,pH值6~9,温度1~30℃,初始芽孢浓度10²~10¹² cfu·ml^-1范围内,消毒剂浓度和反应时间共同影响着氯对芽孢的灭活效果,提高消毒剂投量或延长消毒反应时间,均可提高灭活率;酸性条件下氯灭活芽孢的能力强于碱性条件下;随着温度的上升,氯对芽孢的灭活能力增强;芽孢的初始浓度对氯灭活芽孢的效能影响不大。初始氯投量为8.30 mg·L^-1,pH=7,芽孢初始浓度10⁶ cfu·ml^-1,温度分别为5℃和25℃下,枯草芽孢杆菌对氯消毒剂的抗性强于炭疽芽孢杆菌。