电镜核酸分子原位杂交技术的探索

显微水平的核酸分子原位杂交技术已广泛地应用于基因在染色体上的定位,发育过程中的基因表达等方面,但电镜水平的原位杂交技术却仍在探索之中,主要因为剧烈的核酸分子杂交条件与样品精细结构的保存之间存在着矛盾,为此,我们分别在分级抽提的整装细胞,L-K_4包埋或Epon812包埋的超薄切片样品以及DGD包埋-去包埋样品中对进行电镜分子原位杂交研究的可行性和杂交条件进行了一些探索,目前在整装细胞样品中已取得初步的结果。     

高分辨扫描电子显微镜免疫标定鸡脑下垂体细胞

透射电子显微镜免疫细胞化学法早已被广泛应用於内分泌细胞之位置确定的研究工作。更因为目前对胶质金(Colloidal gold)的特性有所了解,知其易於配制成各种不同尺度的颗粒(1)。因此,可进一步的完成双次或多方免疫标定,以达到在同一切片样品上做多种内分泌细胞分辨的目的。自从数年前高分辨扫描电子显微镜(HR-SEM)问世后,已因它的高分辨特性而允许在细胞样品上做对细胞内部的扫描研究工作。吾人曾发表以O-D-O方法与HR-SEM显示出细胞内部结构以及各种不同细胞之鉴定(2—4)。而本篇报告之目的在於以新的样品制作技术,利用高分辨扫描电子显微镜免疫标定法来鉴定分析鸡的脑下垂体细胞。     

肝细胞HBV原位核酸杂交及电镜观察

电镜原位分子杂交技术,对病毒性疾病的诊断,肿瘤的基础研究及临床诊断以及核酸的细胞定位有重要意义。它是利用已知序列的DNA或RNA片段为探针,按碱基配对的原则去识别与之互补的靶DNA或RNA,形成DNA-DNA或DNA-RNA的杂交。通过生物素化的探针与胶金的络合物以及同位素化的探针显示结果,从而达到检测和分析的目的。该技术具有特异性强,灵敏度高,定位准确的特点。例如可利用已知的病毒癌基因及细胞中的癌基因,采用原位杂交的方法在电镜水平进行肿瘤学的研究。也可测定病毒基因的位置和特定基因在染色体上的定位。我们利用生物素化的HBV-DNA探针与胶金的络合物(HBV-DNA-G prob)对肿癌病人肝细胞内HBV进行了检测。     

植物病毒样品的超薄切片技术研究

应用超薄切片技术及电镜检测植物病毒在寄主细胞中内含体的形态,是确认病毒的可靠手段之一。然而由于超薄切片的效果与取样及固定处理程序等有直接关系,植物细胞内含物质对观察病毒在细胞中的存在影响很大,目前常规的生物处理程序,对观察病毒在细胞内的形态都不理想,作者近两年在植物病毒样品的前处理上进行了一系列实验研究。样品先经0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)处理12小时,再行常规固定、包埋切片程序,获得了明显效果。选三种病毒材料,萝卜(TuMV)、克里夫兰烟(CMV)、蔓陀岁(PXV)。样品采集后,切成1     

一种拟病毒在辣椒细胞内复制的电镜观察

病毒的基本结构都是由蛋白质衣壳和衣壳包裹着的核酸所构成。91年我们曾用电镜负染技术在辣核上发现一种新的10nm左右含RNA的等轴对称核蛋白病原体。虽然它已具备病毒的基本结构特征,但我们还未及做病毒学上的全面鉴定,故暂且称它为“拟病毒”。本文就其在辣椒叶肉细胞中的复制作一初步探讨。     

牛传染性鼻气管炎病毒与山羊痘病毒在细胞表面释放的研究

用高分辨扫描电镜与细胞表面复型穿透电镜技术结合研究了牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)与山羊痘病毒(GPV)从细胞表面释放的详细过程,不仅为病毒多种释放形式提供了表面形态的细节,而且可为病毒的外部形态,病毒在细胞表面的释放数量,释放部位以及病毒与细胞表面关系等提供更多的信息。尤其是能揭示在超薄切片上无法弄清楚的“绒毛”释放形式。     

应用电镜原位分子杂交技术对腺病毒DNA在宿主细胞内进行定位

以Biotin标记的dATP(Bio-7-dATP)通过缺刻翻译(Nick Translation)制备腺病毒的基因组探针,建立了电镜原位杂交技术,并研究腺病毒感染的HeLa细胞内病毒DNA的分布。结果表明,免疫胶体金颗粒特异地标记在腺病毒感染的细胞核内,并且在核内呈区域性分布。整装抽提后的细胞原位杂交结果显示出,胶体金颗粒呈族状马串珠状结合在核骨架上,从而在形态学上证实了腺病毒DNA与核骨架的紧密结合关系。     

逆转录病毒-从实验小鼠外周血浆细胞中检出

应用超薄切片透射电镜技术在实验Balb／C小鼠外周血浆细胞中意外地检出逆转录病毒。病毒粒子有包膜,呈球形,直径约100nm,包膜表面有纤突,病毒核衣壳在粗面内质网内膜上芽生成熟：该病毒被疑为小鼠体内的潜在性感染,应该引起实验动物生产部门的关注。     

电镜在病毒感染诊断中的应用

本文系统温习了动物病毒分类与命名以及人类重要致病病毒电镜诊断的形态学指征。自１９６９年以来，我们应用超薄切片，负染和免疫电镜技术对６００余份病毒感染的培养细胞，实验动物组织以及少数临床样品（血清和粪便病毒提取液以及皮肤活检组织等）进行了电镜检查和诊断。检出的病毒有：触染性软疣病毒、鼠痘病毒、疱疹病毒、原病毒、人乳头瘤病毒、马脑炎病毒、乙型脑炎病毒、登戈病毒、流感病毒、鼠副流感病毒、合胞病毒、狂犬病     

激光荧光显示法病理活检组织荧光显微镜观察

作者让患者口服荧光素钠后间隔不同时间作阴道镜及胃镜检查时，取活检组织，作成连续切片，追踪了荧光素钠在癌与非癌组织成份中的渗入情况，并以细胞化学法验证了荧光现象与核酸的关系。研究病例均为临床病理活检确证者，共8l例，     

超薄切片免疫酶电子显微术的改进和应用

超薄切片免疫酶标记技术把形态和免疫反应的研究较好地结合在一起,是一种行之有效的功能电镜技术。作者简化和改进了此项技术,对改进后的实验程序作了介绍。本文列举实例;(1)利用此技术,对长期不清的流行性出血热病毒作了形态学鉴定;(2)利用该方法研究了单纯疱疹病毒糖旦白的形态发生学。从而证明改进了的超薄切片免疫酶标记技术,能为结构和功能的研究提供许多重要资料,值得在生物医学研究中推广使用。     

尖锐湿疣的电镜诊断

目的：观察尖锐湿疣疣体细胞和病毒的超微结构,为临床诊断提供确切的形态学依据;评价电子显微镜诊断尖锐湿疣的价值。方法：采用透射电镜观察尖锐湿疣组织超薄切片。结果：疣体上皮棘细胞、基细胞明显增生,可见成群的挖空细胞和肿胀坏死细胞。在少数感染细胞核内可查见呈晶格状排列或散在分布的人乳头瘤病毒颗粒(HPV)。结论：查见病毒颗粒对尖锐湿疣有明确诊断价值,但阳性率较低;上皮细胞增生性改变结合典型的挖空细胞对尖锐湿疣的诊断有重要参考价值。     

新合成的痘苗病毒DNA与中间纤维的相关

应用电子显微镜放射自显影技术与DGD包埋-去包埋技术相结合证明新合成的痘苗病毒DNA结合在中间纤维上,这不仅对于深入了解病毒DNA复制方式,而且对于了解细胞骨架的结构与功能都有重要的意义。痘苗病毒的一步生长曲线显示,在痘苗病毒感染8小时,已有成熟病毒粒子释放出来,感染24小时病毒滴度达到最高峰。电镜超薄切片样品显示在痘苗病毒感染4小时,细胞形态无明显变化,感染8和12小时,病毒工厂开始出现,并可观察到其中未成熟的病毒粒子。感染24小时,大量的成熟病毒粒子出现在病毒工厂中或释放到细胞外。根据显微自显影数据绘制的病毒的DNA合成动态曲线表明病毒感染后4小时病毒DNA合成达到高峰,随后逐渐下降。     

早期流产组织冰冻切片中胚胎成分的分离检验

目的：建立激光捕获显微切割技术与低体积扩增技术联用,进行冰冻切片上胚胎与母体成分DNA的分离检验技术。方法：制备早期流产组织冰冻切片,通过激光捕获显微切割胚胎绒毛细胞,设置10,20,30个细胞数目梯度,比较各组胚胎成分DNA的STR分型的检出率、等位基因丢失率和非特异性扩增情况。最后进行实际样本应用。结果：捕获10个胚胎绒毛细胞即可获得Identifier试剂完整的STR分型。冰冻切片捕获30个细胞数目组的检出率较高,等位基因丢失率和非特异性扩增率较低。结论：激光捕获显微切割技术联用低体积扩增技术可应用于胚胎与母体成分DNA的精确分离和检验。     

新生儿皮肤疱疹病毒感染的电镜诊断

目的：电镜观察疱疹病毒（HV），为临床诊断提供形态学依据；并进一步研究人皮肤HV感染的组织病理变化及形态特征。方法：应用透射电子显微镜观察新生儿皮肤活检组织超薄切片。结果：表皮细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞及神经纤维内均可观察到病毒颗粒，感染病毒的细胞有明显的形态学变化；成熟病毒颗粒直径约150－160nm，核衣壳直径约100－110nm。核衣壳的核心可分为空心型、颗粒型和致密型三种；郎格罕细胞和巨噬细胞数量明显增加。结论：HV可感染皮肤多种细胞及神经纤维；郎格罕细胞和巨噬细胞增生可能在限制病毒复制和阻止扩散中起重要作用；电镜对病毒疾病的诊断和研究具有很大的价值。     

石蜡切片的扫描电镜观察方法

电子显微镜使人们能够用眼睛直观的看到从亚细胞结构的细节到微小的病毒,甚至原病毒颗粒,从核酸蛋白质的生物大分子到小分子甚至原子的形态结构。但美中不足的是,由于微小样品在高放大时的视野局限性以及透射电镜对样品厚度的超薄要求,使得电镜(透射)照片所形成的微小视野平面图像给人们直观了解生物亚显微结构的三维联系和形态与功能的相关分析带来了困难。为补尝这个不足,我们对石蜡切片的扫描电镜观察方法进行了新的探讨。     

高分辨电子显微学之应用於原子层次之医学科学研究

高解像度电子显微镜是最近年来电镜科技进展之产物。在材料物理科学领域,已广泛被应用於观察原子结构影像,而在生物医学方面,原子层次之研究报告却还是屈指可数。因此,本篇研究目的在以超高解像度电子显微镜来探讨各种医学材料原子解像之可行性以提高研究层次。研究材料包括人体内胆结石,动脉粥瘤之胆固醇晶体,亲铬细胞瘤细胞内之儿茶酚胺颗粒,培养中亲铬细胞瘤细胞内结晶体及游离之心肌细胞基底膜。标本制作结石及胆固醇晶体是以研磨成粉,而组织及细胞是以超薄切片。粉末颗粒及超薄切片之标本在日立H—9000型超高解像度电子显微镜下观察,使用的电压为300KV。     

几种病毒核酸的明暗场观察

将暗场技术用于研究生物大分子是近几年来生物电镜发展的一项新技术。在1982年klotz报道了核酸分子的暗场技术后,这一方法逐渐得到了应用,其优点不仅在于操作简单、方便,更重要的是能增加样品的反差,良好地保存核酸分子的精细结构。我们对这项技术作了初步尝式,并得到了较为满意的结果。取适量褐点粉灯蛾核型多角体病毒(Alphaea phasma NPV),分离的鱼类病毒和噬菌体三种病毒样品,先用0.05MNa_2CO_3处理APNPV,然后用二步释放法,将纯净的APNPV,HV和噬菌体分别加入到不同浓度的尿素中,使其蛋白外壳变性。将病毒核酸释放液用细胞色素C进行单分子膜展层,用火棉胶—碳膜的铜网沾取核酸。将部分铜网在无水乙醇中脱水后,进行铂钯金属旋转投影,用于电镜明场观察(见图1—3),而另一部分铜网     

杆状病毒重组病毒对IPLB SF21—AE细胞株之细胞病毒研究

利用含有B型肝炎表面抗原S段基因之重组病毒感染IPLBSF 21—AE细胞株研究其细胞病变并与野生型病毒ACNPV(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)之细胞病变作为比较。重组病毒对细胞较具毒性,于感染细胞中,野生型与重组病毒所产生之子病毒大小与纤维状物质并无差异。但于重组病毒感染的细胞中较易观察到具有二至三倍长的核蛋白质鞘。不同病毒感染的细胞以感染后期之差异较大。野生型病毒感染的细胞核内可见许多含有包埋体病毒的多角体(polyhedra),病毒形成团(virogenic stroma),以及累积之多角体被膜(图1)相反地,重组病毒感染的细胞内并无多角体,但核内可见核蛋白质鞘及已披上被膜之核蛋白质鞘团,并可见明显的膜状构造包围核四周(图2),以及嵌于膜上直径约22nm的电子致密颗粒(图3),此结果证明了重组病毒合成之S蛋白并非以游离方式存在,而是嵌在膜构造内。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒在体内的装配

斜纹夜蛾是粮食、棉花、油料和蔬菜等作物的重要害虫之一。斜纹夜蛾核型多角体病毒能够使斜纹夜蛾幼虫发病而死亡,人们利用某些昆虫病毒防治害虫,已经收到显著的效益。本文应用电子显微技术,对斜纹夜蛾核型多角体病毒在其宿主体内的装配进行了研究。从一系列不同的感染时间,分别对其发病幼虫的脂肪、气管、中肠等三种组织取材,按常规超薄切片法的程序处理,在LKB—2128型超薄切片机上切制,经染色后,于JEM—100C型电镜下观察,通过大量切片的分析,结果表明如下: